Cell | 如何构建人肠道单细胞级发育时空图谱？他们这样做

2021年1月5日，牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所Alison Simmons团队在Cell上发表了题为"Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution"的文章，是目前人肠道发育研究最为全面的一篇文章。文章基于单细胞测序和时空转录组技术，绘制了人肠道单细胞分辨率的发育时空图谱，并描述了肠道发育的几个关键事件，包括隐窝-绒毛的形成、血管的扩张、间充质细胞的分化、肌肉层的建立、免疫细胞的定殖、肠相关淋巴细胞的出现和位点特异的免疫程序等。

文章题目：Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution

发表时间：2021-01-05

发表期刊 ：Cell

第一作者（全部共同一作）：David   Fawkner-Corbet, Agne Antanaviciute, Kaushal Parikh

全部通讯作者：Hashem Koohy & Alison Simmons

主要研究团队：牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所

影响因子：41.582 

DOI：doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.016

研究背景

人肠道是最大的屏障器官，与肠道微生物共生。成熟的肠道包含了多种类型的细胞并且形态独特，但其发育的分子机制仍不清楚。虽然已经在动物模型中进行了肠道绒毛的形成、发育中肠道肌层曲屈力的研究，但肠道的发育具有物种特异性，动物模型的结果不一定适合人类，所以研究人类肠道的发育过程尤为必要。

研究思路

研究取孕龄8周-22周的胎儿肠道回肠末端、结肠始端和结肠末端组织样本，分离上皮细胞和非上皮细胞进行单细胞测序，同时还取了孕龄12周和19周及成人的肠道组织进行了时空转录组分析。研究一共取了17个个体的77个样品进行单细胞测序，8个样品（来源3个个体）进行时空转录组分析。

图1 肠道发育图谱研究设计总览图（来源正文Fig. 1）

研究结果

1. 根据发育时间和空间对101种肠细胞类型进行分类

17个个体77个样品共获得了76,592个细胞，可以分为9大细胞类型，包括内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维/内皮细胞、免疫细胞、肌肉细胞、神经细胞和周细胞。9大类细胞按照不同细胞亚型可以细分为101类亚群。不同细胞类型具有明显的位置和发育时间过程差异性。

图2 人肠道发育时空转录图谱生成（来源正文Fig. 1）

2. 单细胞的空间位置

为了确定sc-Seq得到的单细胞在肠道的空间位置，研究对肠道组织进行了时空转录组分析。每张切片获得5-13个聚类簇，然后将聚类簇定位到切片上。通过sc-Seq数据确定聚类簇的细胞类型，切片的细胞类型与其基因的表达一致，例如粘膜下淋巴滤泡的PTPRC表达和肌间神经丛中RET在相应位点特异性表达。大部分细胞类型在切片上分层出现，只有小部分细胞类型具有同点共现的情况。以肌层黏膜为界，研究鉴定了2,893个与距离相关的基因，肌层黏膜上方（绒毛方向）的基因富集调控绒毛功能、消化系统相关的功能；肌层黏膜下方（肌层方向）的基因富集肌细胞分化、肌肉收缩相关的功能，与细胞类型特征的顺序富集相符合。通过比较不同时间点肌层细胞空间位置的变化，确定胎儿的外肌层和内肌层在19PCW发生分化。

图3 ST和scRNA-seq整合的肠道发育时空分析（来源正文Fig. 2）

3. 肠上皮细胞的发育及上皮干细胞的发育起源

研究通过分离肠上皮细胞进行单细胞测序，共捕获了17,622个上皮细胞，包含了15种上皮细胞类型，可以区分为吸收性、分泌性、未分化和干细胞。不同类型的上皮细胞具有位点和发育时间差异。随着发育时间的推移，观察到上皮的大量细胞重塑，到12周，肠道的细胞组成与成人相似。这些结果说明在隐窝形成之前，位置特异的转录程序就已经在发育中建立。

肠上皮干细胞随着时间的增加而增多，但是在孕早期，干细胞高表达的基因已经存在位点特异性。近端早期肠上皮细胞表现出一些与肠上皮细胞发育相关的功能基因的转录，包括VTN、ONECUT2、GATA4、TF；LGR5是肠上皮干细胞的特征基因，在近/远端干细胞细胞表达，且在孕早期弥散表达，12PCW后在隐窝底部聚集，一直维持到成年。其下游的细胞去分化相关基因ASCL2也是随着时间的增加表达量增加。

图4 子宫内上皮细胞成熟和隐窝发育（来源正文Fig. 3）

4. 间充质细胞和内皮细胞区间的协调发展

这部分分析涉及了肠道血管的形成、肠神经系统和固有肌层建立。

肠道内皮细胞可以分为动脉、静脉和淋巴类，并通过血管的大小进一步区分为12类亚群。在发育过程可以观察到小血管向大血管过渡的过程。位于血管周围的周细胞，其发育滞后于血管。周细胞与肌成纤维细胞和原始的ACTA2 +细胞共享转录特征，表明早期成纤维细胞向周细胞过渡，然后是来自未成熟WNT6表达细胞的第二波周细胞增殖-分化。

和肠道的其他部分相比较，肠道神经细胞出现得比较早，鉴定了5类神经元和7类胶质细胞，从ST结果中可以观察到神经元被肌肉组织包裹。

肌细胞共鉴定了11类亚型，12PCW就可以观察到肠肌内层和肌外层的形成，且在不同的肠段，形成的先后顺序不同，但在19PCW才能在ST的结果中观察到不同的肌层。

成纤维细胞细分为16类细胞群，而S3成纤维细胞亚型与内皮细胞具有大量的相互作用，其聚集在大血管的周围，说明S3成纤维细胞亚型具有作为肠道血管支撑性生态位的可能作用。

图5 间质细胞和内皮细胞区间的协调发展（来源正文Fig.4）

5. 引导肠道发育形态发生梯度的无偏映射

了解肠道发育的一个基本问题是局部形态原梯度及其拮抗剂如何塑造肠道绒毛形态发生。为此，研究人员确定了8条涉及形态基因的通路，用于说明这些分子在时间和空间的作用。

研究共表达分析确定了11种类型细胞和13种空间共定位的形态发生模块，并在切片中对这些模块的活性进行了评分。这些模块与细胞在ST的位置有关。模块3涉及内皮细胞、祖细胞和成纤维细胞，可能与这些细胞的形态起源有关，并且这些基因位于切片深处；模块8是上皮细胞特异的IHH通路，包含Wnt信号中起重要作用的卷曲的共受体LRP5，并位于管腔附近。模块11包含了肌成纤维细胞具有形态发生的WNT2B及其受体RSPO2，在12PCW时呈弥散状分布，到了19PCW时发生聚集，与成熟肌纤维细胞出现在上皮成分后的发现一致，表明ISC-成纤维细胞信号传导回路在隐窝形成后才建立。

研究还发现S2成纤维细胞特异的基因可以形成一个位于黏膜下成纤维细胞形态发生的模块，表明了S2成纤维细胞及其提供的富于形态的基质在上皮细胞形成中的重要性。S2成纤维细胞在不同肠段的基因表达情况不一样，在10PCW前就检测到许多位置特异的表达，表明在隐窝形成前就具有很强的位置同一性。S2成纤维细胞通过这种位置的差异性，发展出形态不同的上皮。通过免疫荧光，确定了S2成纤维细胞的marker基因F3基因在隐窝形成之前就已经存在，并随着绒毛的形成而向上增加，说明S2成纤维细胞不仅是维持上皮隐窝位所必需的，而且可能在其形成中发挥积极作用。

图6 特定细胞类型和空间位置的肠道形态梯度（来源正文Fig.5）

6. 人肠道免疫的发展

整个发育过程共获得6大类免疫细胞，包含12类亚细胞，小肠免疫细胞含量要多于结肠，且免疫细胞在12PCW后才大量出现。派尔斑块是有组织的淋巴滤泡，为肠黏膜免疫系统的重要组成部分。之前的研究认为派尔斑块出生前在小肠中形成，出生后转移到结肠。但该研究发现，结肠特异性的胶质细胞群表达基因GFRA3（GFRA3缺乏会导致派尔斑块发育受损），并且是唯一表达的来源，说明结肠发育期间可能存在类似的神经免疫回路。

派尔斑块形成关键介质基质细胞表达的基因CCL19、CCL21、CXCL13在S4成纤维细胞中表达，且S4成纤维细胞与免疫细胞具有互作，支持了S4成纤维细胞在淋巴组织形成中的作用。空间上，免疫细胞和S4成纤维细胞在淋巴滤泡和周围表达，也说明了S4成纤维细胞是淋巴结构的形成和维持基石。

另外，S4成纤维细胞很大程度上为小肠特异，维持子宫内派尔斑块的发育，但不维持结肠关淋巴组织。两类S4成纤维细胞具有差异性，S4 CXCL13 +亚型表现出许多隐窝周围S2成纤维细胞的关键特征，表明了派尔斑块相同的隐窝成纤维细胞起着上皮隐窝位支持细胞、淋巴组织形成的协调者和间质免疫串扰介体的作用。

图7 早期肠道免疫定殖和免疫-基质相互作用（来源正文Fig.6）

7. 绘制先天性肠道疾病的细胞基础

为了研究先天性肠道疾病的发病机制，结合本研究肠道sc-Seq的数据与人类表型本体论(HPO)中围产期肠道疾病列表进行关联，并用遗传表型进行注释。整合749个已知的肠道疾病基因与单细胞测序数据，发现这些肠道疾病可能是高度细胞类型特异缺陷导致的。例如远端肠上皮细胞SPINT2和DGAT1基因，其缺陷可能导致严重的先天性腹泻；SOX10和RET与Hirschsprung病（肠道神经节病）相关并在神经细胞中表达，包括与淋巴相关的神经胶质细胞。同时还可以研究随发育时间变化而变化的疾病，HMGA2在12PCW的肌细胞和神经细胞表达，与肠道旋转不良有关；早期抑制性运动神经元特异性NXN的致病变异可能导致脐疝；这个发育时间肠道会回到腹部，而这些研究结果表明了，肌肉细胞和神经细胞对肠道回到腹部的关键作用。

图8 子宫基因表达谱在发育性肠道疾病中的应用（来源正文Fig.7）

总结

文章结合了单细胞转录组和时空转录组技术，在时间层面详细描述了人肠道各类细胞在肠道发育过程的作用，以及细胞间的相互作用，使得人类对肠道发育研究达到了单细胞的水平；最终，将所有资源整合形成了在线的公开资源（STAR-FINDer，https://simmonslab.shinyapps.io/FetalAtlasDataPortal），为后续肠道的研究提供了很好的平台。

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