Nat Neurosci | 单细胞原位转录组图谱揭示哺乳动物大脑皮层中星形胶质细胞分层

来自英国剑桥大学和美国加州大学旧金山分校的研究团队开发了一个高通量自动化流程，构建了大面积空间转录组（Large-area Spatial Transcriptomic, LaST）图谱管道，可以原位定量单细胞基因的表达。通过筛选候选基因，并利用scRNA-seq和空间重建分析证实了哺乳动物大脑皮层中存在星形胶质细胞分层。该文章在2020年3月发表于Nature Neuroscience，以下是文章的详细解读。

文章题目：Astrocyte Layers in the Mammalian Cerebral Cortex Revealed by a Single-Cell in situ Transcriptomic Map

发表时间：2020-03-16

发表期刊：Nature Neuroscience

主要研究团队：英国剑桥大学、美国加州大学旧金山分校等

影响因子：20.071

DOI：10.1038/s41593-020-0602-1

研究背景

星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中胶质细胞的一种。它们与神经元、其他胶质细胞和血管细胞等多种细胞相互作用，支持中枢神经系统结构、营养、血流调节、血脑屏障、突触形成和活动，并与许多脑部疾病有关。

长期以来，许多神经生物学家认为星形胶质细胞只是起支持神经元作用的次级细胞，与神经元在大脑中的异质性不同，星形胶质细胞是同质性的。但近年来随着神经分子生物学、神经电生理学和神经影像等技术的发展，科学家们开始重新评价胶质细胞的功能，提出了星形胶质细胞异质性或多态性的新概念，但皮层结构背后的神经胶质空间组织的精确分子特征仍不清楚。

研究策略

研究人员综合利用单分子荧光原位杂交（smFISH）、RNA原位杂交（RNAScope）、免疫组化学（Immunohistochemistry，IHC）、快速共聚焦成像技术, 以及小鼠全脑标准冰冻切片的细胞分割和定量分析，开发了一种高通量自动化筛选哺乳动物大脑中原位单细胞基因表达的方法，并使用P14小鼠的大脑皮层验证了技术的可靠性。使用Aldh1L1-GFP转基因小鼠的大脑皮层分析皮质星形胶质细胞的分层基因表达特征；通过scRNA-seq技术检测了皮质星形胶质细胞的分子异质性，并用Louvain方法进行聚类分析，在P56小鼠皮质中鉴定出两种主要的星形胶质细胞亚型。最后，利用贝叶斯模型进行空间重建揭示了星形胶质细胞分层。

研究成果

1.  构建LaST图谱管道并验证其可靠性

研究人员综合利用smFISH、RNAScope、IHC、快速共聚焦成像，以及小鼠全脑标准冰冻切片的细胞分割和定量分析，开发了一条大容量的管道，即LaSTmap管道（图1A）。

为了验证LaST图谱管道的可靠性，研究人员取P14小鼠整个大脑皮层10张前后切片进行自动六色成像（图1B~1H），总计有2,216个视野和25 h内连续采集约300,000张图像，检测每层特异性神经元的基因表达，并用每层已知标记基因的神经元（L2~4 Cux2、L4 Rorb、L5~6 Bcl11b、L6 Foxp2）进行验证。结果显示，LaSTmap管道能够准确识别已知层特异性单细胞，确定层特异性神经元基因的表达，且具有很强的可重复性。

图1 LaST图谱管道流程及原位绘制的皮层神经元亚型

2. 皮质灰质星形胶质细胞的分层基因表达特征

灰质星形胶质细胞在L2~5是分子均一还是分割成多个不同的层？研究人员获取了2周龄Aldh1L1-GFP转基因小鼠大脑皮层，包括体感皮层的上层（L2~4）和深层（L5~6），并对经流式细胞荧光分选技术 （FACS）分选的星形胶质细胞进行了RNA-seq分析（图2A），发现星形胶质细胞的标志物（Aldh1L1）在GFP阳性细胞中高度富集，而不是预期的富集在GFP阴性细胞或整个皮层，且大多数层神经元标志基因在皮质星形胶质细胞中没有表达。研究人员证实灰质星形胶质细胞不是分子均一，并确定了159个候选基因，这些候选基因在上层和深层的星形胶质细胞具有不同的表达（图2B）。

接着，研究人员利用smFISH技术寻找星形胶质细胞的特异性基因，检测了星形胶质细胞（Aldh11l、AldoC、Glast）、神经元（Syt1、NeuN）、少突胶质细胞（Pdgfrα、Plp）、小胶质细胞（Tmem119）和内皮细胞（Tie1）的标记物。结果显示，Glast mRNA主要聚集在星形胶质细胞中表达，确定了星形胶质细胞的特异性基因（图2C~2G）。

最后，研究人员从皮质层和星形胶质细胞特异性差异富集基因中选择前46个基因（图2H），根据原位定量的结果，发现骨形态发生蛋白拮抗剂Chordin-like1（Chrdl1）在L2~4层星形胶质细胞中表达，而白细胞介素33（IL33）富集在L5~6层星形胶质细胞中；上皮角化包膜的组成部分Sciellin（Scel）在中层（~L4）星形胶质细胞表达，而转录抑制因子Id1和Id3占据了深层（L5~6）和边缘层（L1）。这些发现表明，灰质星形胶质细胞表现出空间分层的基因表达异质性。

图2 通过RNA-seq和LaST揭示灰质星形胶质细胞之间新的层基因表达差异

3. 星形胶质细胞层与神经元分层的关系

为了确定星形胶质细胞层与兴奋性神经元是否一致，研究人员直接在原位比较P14躯体感觉barrel皮质中8个顶层星形胶质细胞标记物与细胞层神经元标记物的空间表达模式，发现星形胶质细胞层基因通常分为浅层、中层和深层3个空间区域。其中Chrld1、Scel、Eogt、Spry1、Paqr6和IL33的表达跨越了多个神经元分层（图3A~3D）。Chrdl1表达在L2~4层中达到峰值，在L1和L5层中则较低。Scel表达在L4~5层中最高，在L2~3层中部则有一个上限。IL33表达在L5层中达到峰值，在L4和L6层中处于低水平。这种表达似乎与不同层次间星形胶质细胞大小或Glast表达水平没有直接相关性。

Gfap、Id1和Id3在L1层灰质星形胶质细胞和白质中都有表达，而L5-6层灰质星形胶质细胞富含IL33，但白质中不存在，表明深层星形胶质细胞的特征不同于白质。

总之，星形胶质细胞跨皮质灰质分为多层，并且神经胶质分层与经典神经元分层不同（图3E）。此外，这种模式从P14开始就很明显，一直持续到成年，并保存于人类皮层中。

图3 星形胶质细胞在整个大脑皮层中均表现出较广泛的表达梯度，且不同于神经元的分层

4. 单细胞转录组数据揭示星形胶质细胞分层

为了独立验证星形胶质细胞分层，研究人员通过scRNA-seq检测了皮质星形胶质细胞的分子异质性（图4A）。用Louvain方法进行聚类分析，在P56小鼠皮质中鉴定出两种主要的星形胶质细胞亚型，分别命名为AST2和AST3，分别通过Unc13c和Agt的表达来区分（图4C），并发现它们在整个皮质层中大量混杂。研究人员进一步在scRNA-seq数据中检测了基数层星形胶质细胞标记物的表达模式，发现在单个星形胶质细胞转录组数据中层星形胶质细胞标记物在细胞亚群中表达，但没有以聚类相关的方式表达（图4D）。以上表明，皮质中可能存在多个星形胶质细胞异质性轴（即层状和非层状）。

为了推断在scRNA-seq中分析的皮质细胞层位置，研究人员使用贝叶斯模型进行空间重建，并通过scRNA-seq的聚类分析（图4B），鉴定出两种皮质星形胶质细胞亚型位于多个分层，这与它们在空间上相互混合的观察结果相一致。使用替代SC3方法衍生的scRNA-seq簇显示出类似的非层特异性分布。综上，皮质中星形胶质细胞显示出至少两个分子异质性轴：1）通过scRNA-seq数据的无监督聚类检测到的层独立的异质性；2）基于smFISH和scRNA-seq数据的空间重建显示出的层依赖的异质性。

为了扩大星形胶质细胞层标记物的保存库，研究人员进行单细胞转录组的空间重建，得到125个具有层相关表达特征的基因。层相关星形胶质细胞候选基因平均占每个细胞19%的转录本和8%的表达基因；其中，2/3被预测表现出上层和深层星形胶质细胞的表达（类似于Chrdl1和Il33），而其余1/3的基因表现出白质样层表达谱（类似于Id3；图4G）。研究人员利用smFISH进行部分验证，如图4H~J所示，转录调控因子核蛋白1（Nupr1）在L2~4星形胶质细胞中表达最高，而环氧化物水解酶2（Ephx2）和蛋白脂质神经蛋白（Nnat）在L5~6深层星形胶质细胞中表达较高。

图4 根据单细胞转录组数据对星形胶质细胞分层进行空间重建

5. 神经元的分化直接或间接决定星形胶质细胞层状基因表达

为了研究神经元因子是否调节星形胶质细胞层组织，研究人员将P14小鼠条件性敲除Satb2（与诱导神经元有丝分裂后期相关的基因）（Satb2 cKO小鼠），发现在Satb2 cKO小鼠中L4神经元（Rorb，Pamr1）不存在，而 L2~3神经元显示一些异位深层基因表达（Bcl11b；图5A、5C）。因而，研究人员发现星形胶质细胞中Scel表达完全缺失，而上层星形胶质细胞基因Chrdl1和Eogt显著降低（图5B、5D），深层星形胶质细胞基因（Il33、Id1、Id3）不受影响。这些发现表明，有丝分裂后L4特异性神经元身份对于表层星形胶质细胞身份的产生是必要的。

接着，研究人员利用Reeler（Reln）小鼠（Reeler是与诱导神经元有丝分裂后期相关的基因）评估与神经元相关的深层星形胶质细胞特性。在Reln小鼠中，兴奋性神经元被正确指定，但未能迁移到其适当的层，在出生前产生“由内而外”的皮层。与预想的一样，在P14，表层（Cux2）和深层层状标记物（Bcl11b、Foxp2）的表达模式被反转，而L4神经元（Rorb）在皮层深度形成异常簇（图5E~5G）。此外，研究人员发现表层和深层星形胶质细胞层是倒置的。与L4神经元表型一致，Scel阳性星形胶质细胞异常地定位于皮质深度。总之，以上结果表明，皮质神经元信号参与了星形胶质细胞层发育的调节（图5I）。

图5 有丝分裂后神经元引导建立星形胶质细胞分层的证据

6. 星形胶质细胞层特征因皮质区域而异

研究人员量化P14小鼠皮层顶层星形胶质细胞标记的模式，以研究星形胶质细胞的分布。如图6所示，星形胶质细胞层基因表达在背腹侧和前尾侧皮质中显著变化。Scel基因的表达在体感区域L4~5星形胶质细胞中富集，但在内侧运动和尾部视觉皮层缺失（图6A、6B），这种模式与L4神经元密切相关（图6D）。在另一种不同的模式下，Chrdl1在整个皮层的L1~4星形胶质细胞中显示出背腹侧富集（图6C），而深层星形胶质细胞标志物表达在背腹轴的内侧和外侧区域富集（Il33、Id3）。因此，星形胶质细胞在整个皮层中表现出层状和区域异质性。总之，以上结果表明，神经胶质层是皮质层和区域结构的基本生物标志物特征。

图6 星形胶质细胞分层特征在各皮质区域之间存在变化

结论

LaSTmap可以作为一种强大的技术来验证单细胞基因的原位表达，并发现了表明细胞多样性的组合模式。研究人员结合LaSTmap，发现星形胶质细胞的细胞层模式不同于兴奋性神经元，是一种具有更高阶复杂性的复合“神经胶质”皮质结构。这一发现重新定义了我们对哺乳动物大脑结构的看法，揭示了星形胶质细胞皮质层的标记物，为了解发育和/或疾病中的特殊功能提供了新见解。

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