Science | MERFISH揭示人和小鼠大脑皮层细胞的保守性和差异性

美国哈佛大学的庄小威研究团队通过自研的多重容错性荧光原位杂交（multiplexed error-robust FISH，MERFISH）技术，实现了对100多种神经元和非神经元细胞群的原位识别，绘制了具有高空间分辨率的人类大脑颞上回（superior temporal gyrus，STG）和颞中回（middle temporal gyrus，MTG）细胞图谱，探讨了细胞空间组织模式在人类和小鼠之间的异同，揭示了不同物种间细胞分布规律的保守性，人类大脑皮层中特有的细胞间的胞体接近模式，以及人类大脑皮层神经元和非神经元细胞之间相互作用。该文章在2022年6月30日发表于Science，以下是文章的详细解读。

文章题目：Conservation and Divergence of Cortical Cell Organization in Human and Mouse Revealed by MERFISH

发表时间：2022-06-30

发表期刊：Science

主要研究团队：美国哈佛大学等

影响因子：63.714

DOI：10.1126/science.abm1741

研究背景

人类大脑皮层由数十亿种不同类型的细胞组成，这些细胞的空间排布和相互作用在形成和维持大脑各种功能中起着至关重要的作用。例如，神经元和非神经元细胞之间的相互作用对于轴突传导、突触传递和组织稳态维持是必不可少的，是大脑正常工作的基础。破坏细胞间的相互作用可能会引发各种神经疾病，如自闭症、精神分裂症和阿尔茨海默病等。人脑中这些不同类型的细胞有怎样的分布规律和相互作用方式，目前仍有待探究。

近年来，scRNA-seq技术迅速发展，通过该技术可以基于转录组信息对细胞类型进行精细划分。应用scRNA-seq技术，已有研究发现人类大脑MTG中存在多种细胞类型，且这些细胞，尤其是兴奋性神经元细胞，表现出规律的层状排布。然而，这些研究并没有在高分辨率下阐明人脑中细胞类型的空间分布关系，不同类型的细胞之间的互作方式也尚不明确。同时，这些特征如何在物种间变化也仍不清楚。

研究样本

人脑样本：从神经外科手术中获取的新鲜冷冻人脑 MTG切片（5份，分别来自36岁和32岁两个男性个体）；从死后的人脑中取得的STG切片（5份，分别来自29岁和42岁两个男性个体）。（研究已通过伦理审查，严格遵循相应法规和伦理准则。）

鼠脑样本：小鼠的初级运动皮层（primary motor cortex，Mop）、听觉皮层（auditory cortex，AUD）、视觉皮层（visual cortex，VIS），以及颞联合区（temporal associated area，TEa）。

研究策略

研究人员利用MERFISH对4,000个基因进行单细胞分析，以确定人类和小鼠大脑皮层内细胞类型的空间分布（图1A）。这4,000个基因包括之前通过SMART-seq在MTG中发现的764个差异表达的标记基因，以及随机选择的其他可能在人脑中表达的基因。

图1 用MERFISH对人类大脑STG和MTG进行单细胞转录组成像

MERFISH是在2015年，由庄小威研究团队开发的一项突破性的单分子成像技术，该技术将选择好的基因制成编码探针，通过组合标注、抗错编码、顺序成像三个步骤，结合标识细胞位置的染色结果，在单细胞水平上鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位，实现高空间分辨的基因组表达测量（图1B）。

进一步，研究人员根据人脑和鼠脑的空间细胞图谱，揭示不同细胞的空间分布规律、可能的相互作用方式，以及不同物种间的差异。

研究成果

1. 人大脑中细胞类型的分类

根据MERFISH的结果，研究人员在人脑的MTG和STG中发现了125个由转录组定义的细胞类型，包括29种兴奋性神经元、39种抑制性神经元，以及57种非神经元（有不同亚类的星形胶质细胞、小胶质细胞、少突细胞核内皮细胞等）（图2）。MERFISH技术对神经元的分类结果和SMART-seq技术类似，但该技术对非神经元的分类结果比SMART-seq技术更精细。这部分结果揭示了人类皮层中不仅有高度多样性的神经元，而且也有高度多样性的非神经元细胞。

图2 基于MERFISH的细胞类型分类结果

2. 人和小鼠大脑皮层中的细胞组成

通过对细胞类型的定量分析，研究发现人类和小鼠大脑皮层的细胞组成有明显差别。与小鼠大脑相比，人类大脑中兴奋性神经元的占比更少，起支撑作用的非神经元占比更大（图3A）。兴奋性神经元的对比结果显示，人类大脑的脑区间投射的神经元（IT神经元）较小鼠更多，说明人类大脑皮层间连接更发达（图3B）；抑制性神经元的对比结果显示，人类大脑中PV神经元较小鼠少，VIP神经元较小鼠多，后者可调节对兴奋性神经元的抑制（图3B）。VIP神经元比例的增加，表明人类依赖性感觉处理能力和与学习相关的神经元动力学能力增强的潜在机制。

图3 人类和小鼠大脑皮层中的细胞组成比较

3. 人和小鼠大脑皮层细胞的空间分布

基于高空间分辨率细胞图谱，研究人员探讨了不同细胞的空间分布规律，并发现人类和小鼠大脑皮层细胞的空间分布特征之间既有相似之处，又有明显差别（图4）。

人和小鼠大脑中神经元的整体空间分布规律很相似，不同类型的IT神经元都呈现出规律的层状排列形式，L5 ET、L5/6 NP、L6 CT和L6b神经元都分布在深层；抑制性神经元的VIP和LAMP5亚类分布在表层，其他抑制性神经元在不同深度均匀分布。非神经元细胞在人类大脑皮层中也表现出分层排布规律，且在人类和小鼠大脑中非常相似。少突胶质细胞主要在较深层和白质中富集，在表层（L1~L3）耗竭；星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、内皮细胞和壁细胞在亚类水平上表现出分层排布规律，但在整个皮层深度中都表现出逐渐演变的细胞组成方式。

图4 人类和小鼠大脑皮层中细胞类型类似的整体空间分布规律

虽然整体的分布相似，但是细节上还是有明显差异的，比如L6b神经元在人类大脑中延伸至L5和白质，而在小鼠大脑中是聚集在L6底部（图5A）；L4/5 IT神经元在人类MTG和STG中形成了致密而薄的层，导致L4中兴奋性神经元的密度显著增加。相比之下，小鼠皮层中L2/3到L6的兴奋性神经元密度更为均匀（图5B、5C）；不同皮层深度下，兴奋与抑制神经元的比例在人脑和鼠脑也有显著差别（图5C）。

图5 人类和小鼠大脑细胞的分布差别

4. 人和小鼠大脑皮层中的细胞相互作用

高空间分辨率细胞图谱使研究人员能够基于细胞在空间上接触或邻近的程度进一步系统地描述细胞相互作用（图6A）。结果表明，人类大脑中细胞相互作用具有类型特异性，并且与小鼠大脑有差别（图6B）。神经元和非神经元细胞之间的相互作用差异尤其明显（图6B、6C）。与小鼠相比，人类大脑中深层的神经元间会形成较多的细胞连接，胶质细胞和内皮细胞连接也更为紧密(图7A、7B)。

图6 人类和小鼠大脑中具有细胞类型特异性的细胞间相互作用

人类大脑中神经元和少突胶质细胞之间的接触或接近度显著增加。人类大脑中一个神经元往往会和好几个少突及其前体细胞相连，这些现象在小鼠大脑中都不存在。由于神经元周围少突胶质细胞可以为神经元提供代谢支持。因此，神经元的少突胶质细胞的接触增加可能是为了适应人脑中神经元放电时有更高的能量需求（图7A、7C）。

与抑制性神经元相比，人类大脑中小胶质细胞和兴奋性神经元之间的接触更紧密，并且越接近皮层表面这种特异性的接触就越富集。卫星小胶质细胞可以帮助维持组织稳态，小胶质细胞具有保护作用，可降低某些神经退行性疾病的发病率。因此，这个发现可能代表了人类小胶质细胞和兴奋性神经元之间的功能相互作用（图7A、7D）。

此外，研究人员发现了小胶质细胞和IT神经元间存在配体-受体对的富集。其中，一些配体和受体对与神经退行性疾病相关，例如α -2-巨球蛋白（A2M）和低密度脂蛋白受体相关蛋白1 （LRP1）与阿尔茨海默病相关，而轴突蛋白（NRXN1/3）与自闭症相关。这表明小胶质细胞与神经元的相互作用与神经退行性疾病存在潜在联系（图7E）。

图7 神经胶质细胞与血管细胞之间以及神经胶质细胞与神经元之间的相互作用

结论

在这项研究中，研究人员通过对人类大脑组织进行4,000个基因的MERFISH成像，实现了100多种神经元和非神经元细胞群的原位识别，并对这些细胞在人类MTG和STG中的空间组织进行了全面的绘制，从而得到了具有高粒度的分子定义和空间分辨率的细胞图谱。人类皮层区域的细胞组成与在小鼠皮层区域观察到的明显不同。细胞的空间组织在人和小鼠之间既有共同的特征，也有不同的特征。该研究结果还揭示了人类和小鼠大脑中细胞相互作用的差异。这种差异在神经元细胞和非神经元细胞之间的相互作用中尤为明显，并且与进化和疾病密切相关。

研究中提供的数据

MERFISH数据来源：https://doi.org/10.5281/zenodo.3264857

SMART-seq数据来源：https://portal.brain-map.org/atlases-and-data/rnaseq/human-mtg-smart-seq

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