呵护“小心肝”，从了解这篇“肝货”开始 | 时空简讯33期

时空简讯第33期。

肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官。在人体内，肝脏是最大的实质性器官、解毒器官、腺体，以及寿命最长的和唯一一个能再生的器官。由于没有痛觉神经，所以肝脏也是人体最脆弱的器官。肝炎病毒、药物、肥胖、酗酒、坏情绪等都可能对肝脏造成损害，且由于其没有痛感，早期缺乏疾病典型症状，发现时一般都较为严重。为此，本期特选了与肝脏发育、结构，以及肝病相关的9篇优质文献并作了精要解读，提供了肝脏生理和病理相关的学术前沿知识，供了解参考。

综述

Review

单细胞和空间转录组在肝生理和病理研究中的应用

Journal of Hepatology [IF: 20.582]

① scRNA-seq和空间转录组都是革命性的技术，如何将它们与临床治疗结合是目前的主要挑战，综述它们在肝脏组织、再生以及慢性肝病和癌症中的细胞之间相互作用方面的应用和发现，以期有所启示。

② 总结了scRNA-seq的技术和原理，提出多种scRNA-seq技术的结合（例如基于微滴的系统和Smart-Seq2）可以产生协同作用，增加捕获罕见细胞类型和低丰度转录本的可能性，给出根据生物学、研究设计和所需的终点为指导来选择合适平台和技术的建议。

③ 回顾了scRNA-seq（或结合单分子RNA荧光原位杂交）在肝脏生理研究中的重要应用，如鉴定了肝脏中肝细胞和肝窦内皮细胞（LSECs）的分区，肝脏发育和再生过程中的祖细胞。

④ 疾病病理方面，列举了scRNA-seq在慢性肝病和癌症微环境研究中的重要成果：表征了慢性肝病和肝硬化中非实质细胞的表型和相互作用，阐明了癌上皮细胞和肿瘤微环境之间的相互作用，揭示肝癌内肿瘤微环境及其异质性，例如，发现Notch信号通路是参与人肝纤维化生态位中细胞相互作用的中心途径等。

⑤ scRNA-seq和空间转录组技术有助于识别肝胆癌新的治疗靶点，并可用于开发更精细的肿瘤分类，以更准确地定制患者的个性化治疗。（TransF/zrz）

原位空间转录组研究示意图

Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology.

2020.06.10, DOI: 10.1016/j.jhep.2020.06.004

综述；消化系统疾病；人，小鼠，肝脏，肝病，肝癌，微环境，scRNA-seq, smRNA-FISH, 空间转录组；Antonio Saviano, Neil C. Henderson, Thomas F. Baumert; Institut de Recherche sur les Maladies Virales et Hépatiques, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Institut Universitaire de France, University of Edinburgh, France.

肝脏的发育：对器官和组织形态发生的见解

Journal of Hepatology [IF: 14.911 ]

① 回顾了肝脏发育过程中的关键形态发生步骤，从肝前内胚层阶段到出生后阶段，并在关注哺乳动物肝脏的同时考虑了几种模式生物（如斑马鱼、鸡等）。

② 从肝祖细胞的来源、器官芽形态发生、肝不对称三个方面讨论了肝脏如何从内胚层中发芽并产生不对称的肝脏；内胚层的3个邻近区域产生双能肝祖细胞，最终分化为肝细胞和胆管细胞。

③ 概述了驱动肝脏和肝叶生长的机制，回顾了肝内和肝外胆管的形态发生，并讨论了胆管对肝损伤的形态发生响应。

④ 从肝内皮细胞的来源，以及静脉、动脉和血窦的形态发生角度描述了驱动肝血管系统形成的机制。（Lina）

肝母细胞的起源和肝出芽的早期阶段

Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.

2018.01.13, DOI: 10.1016/j.jhep.2018.01.005

综述；人，小鼠，斑马鱼，肝脏，形态发生，发育，单细胞分析，空间转录组；Elke A. Ober, Frédéric P. Lemaigre; University of Copenhagen, Université catholique de Louvain, de Duve Institute; Denmark, Belgium.

发育与结构

Development and Structure

Ly49E表征不同造血来源和不同功能的肝脏ILC1

The Journal of Experimental Medicine [IF: 17.579]

① 从3只成年C57BL/6（B6）小鼠肝脏或脾脏中流式分选CD45⁺ NK1.1⁺NKp46⁺ CD3⁻CD19⁻1型ILCs（type 1 innate lymphoid cells，ILC1）进行scRNA-seq，得到了约2,000个肝或脾细胞，平均表达1,400个基因，鉴定出5个细胞亚群并进一步分析ILC1的细胞组成，揭示其在不同组织中转录、发育和功能上的异质性，阐明ILC1在个体发育过程中发生的来自不同来源的动态变化。

② 分析传统NK细胞（conventional natural killer，cNK）和ILC1的特征基因，定义出cNK细胞的3个不同发育状态的亚群（C1~C3）和ILC1细胞的2个亚群（C4和C5），并表征C5是一群在肝脏中特异表达Ly49E的ILC1。

③ Ly49E的表达可以将ILC1分为Ly49E⁺ ILC1和Ly49E^- ILC1两个不同造血来源、不同功能的亚群，发现Ly49E⁺ ILC1主要依赖于胚胎造血和出生后的自我维持，且具有高度的细胞毒性和对外界刺激的敏感性，而Ly49E^- ILC1主要来自于出生后的造血，并且表现出固有免疫细胞的典型特征。

④ 利用表达eGFP的重组鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）感染新生小鼠探究Ly49E⁺ ILC1的富集在早期生命免疫防御中的作用，发现MCMV感染可诱导新生小鼠肝脏Ly49E⁺ ILC1快速反应，以及GzmB、穿孔素和IFN-γ的高水平表达，并利用肝脏ILC1缺陷小鼠（Tbx21^-/-）进一步验证肝脏Ly49E⁺ ILC1是早期病毒感染的重要效应因子。（徐晓静）

ILC1流式分选和scRNA-seq数据分析流程图

Ly49E separates liver ILC1s into embryo-derived and postnatal subsets with different functions.

2022.03.29, DOI: 10.1084/jem.20211805

研究文章；小鼠，肝脏，ILC1，cNK，病毒感染，scRNA-seq，流式细胞分析；Yawen Chen, Xianwei Wang, Hui Peng, Zhigang Tian；中国科学技术大学，中国医学科学院；中国

正常人类肝脏的空间转录组分析

Scientific Data [IF: 8.501]

① 采用空间转录组研究正常人类的肝组织切片，在转录水平上提供了肝脏分区的详细空间信息（https://github.com/yuGithuuub/Normal_liver_visium），有利于肝脏空间异质性的研究，并为肝脏疾病病的研究提供了参考。

② 介绍了肝脏空间转录组方法，整个过程包括获取人肝组织、制备冷冻切片和空间分析样品处理。

③ 质控（quality control）后，从2名人类捐赠者的正常肝脏中获得了6,581个高质量的spots，可分为15个细胞簇，每个簇包含48~1,379个spots。

④ 进一步分析显示，大多数细胞为肝细胞，与预期结果一致；肝细胞沿小叶轴被分为4个亚群，分别命名Zone 1（靠近门静脉）、Zone 2-1、Zone 2-3、Zone 3（靠近中央静脉）。（Lina）

人类肝脏的空间转录组分析流程示意图

Spatial transcriptome profling of normal human liver.

2022.10.19, DOI: 10.1038/s41597-022-01676-w

研究文章；人，肝脏，空间转录组；Shizhe Yu, Haoren Wang, ZhiyongYu, ZongpingXia; 郑州大学第一附属医院，云南大学附属医院；中国

相关疾病

Related Diseases

肝细胞癌免疫抑制内皮细胞胎样发育重编程机制的研究

Cell [IF: 41.582]

① 使用scRNA-seq分析人类胎儿、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和小鼠肝脏的212,000个细胞，全面地表征了人类肝脏从发育到疾病的单细胞景观，揭示了一个全新的可同时驱动胎肝发育和HCC的免疫抑制的“肿瘤-胚胎生态系统”，为HCC的治疗干预提供了新的靶点。

② 通过Louvain聚类分析，来自14例HCC患者和1例正常供体肝脏的75,000个细胞被分成29个亚群，并发现某些细胞类型中存在的肿瘤和癌旁组织的特异性分群，表明HCC中肿瘤微环境可能发生了重编程。同时，在肿瘤核心、肿瘤外周及癌旁组织中发现了不同特征的内皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。

③ 肿瘤和癌旁组织中内皮细胞（n=11,672）和巨噬细胞（n=8,102）是差异显著的两种细胞类型，对两者亚群进一步细分，分别得到11、9个亚群。其中，内皮细胞亚群中PLPP3⁺、IGFBP3⁺、PLVAP⁺在肿瘤组织中富集，且质膜囊泡相关蛋白（PLVAP）在肝脏发育和疾病中发挥重要作用；巨噬细胞主要在肿瘤中富集，HCC中单核细胞来源的巨噬细胞可能被重编程以获得胎儿样表型。

④ 跨物种比较分析显示，小鼠胚胎、人胎肝和肿瘤巨噬细胞之间具有显著的相似性，表明在HCC中肿瘤相关巨噬细胞的胎儿样重编程；空间转录组进一步揭示了胎肝和HCC之间存在共享的“肿瘤-胚胎生态系统”。

⑤ 基因调控分析、空间转录组和体外功能分析表明，VEGF和NOTCH信号通路在维持“肿瘤-胚胎生态系统”方面发挥重要作用。（潘宏伟/Lina）

HCC肿瘤的scRNA-seq分析流程图

Onco-fetal reprogramming of endothelial cells drives immunosuppressive macrophages in hepatocellular carcinoma.

2020.09.24, DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.040

研究文章；消化系统疾病，癌症；人，小鼠，肝脏，肝细胞癌，内皮细胞，巨噬细胞，肿瘤-胚胎生态系统，scRNA-seq，空间转录组；Ankur Sharma, Justine Jia Wen Seow, Charles-Antoine Dutertre, Pierce K.H. Chow, Florent Ginhoux, and Ramanuj DasGupta; Genome Institute of Singapore, Duke-NUS Medical School, 上海交通大学; Singapore, 中国

疟原虫感染肝脏单细胞图谱揭示宿主和阶段依赖性表达模式

Cell Host & Microbe [IF: 31.316]

① 利用微模式共培养（micropatterned co-cultures，MPCCs）技术和Seq-Well（一种低成本和便携式单细胞技术）平台，联合培养和收集流行区感染的单个人肝细胞，对1,494个间日疟原虫和33,383个肝细胞进行双重单细胞测序分析（即利用scRNA-seq和靶标疟原虫全基因组核苷酸诱饵进行的标签转录组测序），绘制了疟原虫及所感染宿主肝脏的单细胞转录组图谱。

② 利用疟原虫全基因组核苷酸诱饵的标签转录组测序，对疟原虫样本进行捕获和重测序，可显著提高基因和转录本的检测效率。

③ 利用间日疟原虫感染的双重转录组分析数据，采用Seurat对疟原虫转录组进行聚类，得到8个疟原虫簇，同时进行单细胞的UMAP（uniform manifold approximation projection，UMAP）可视化分析发现，这8个疟原虫簇对应于不同的肝脏发育阶段，解释了寄生虫和宿主间存在宿主和阶段依赖性的表达模式。

④ 间日疟原虫感染的肝细胞中干扰素（interferon，IFN）和炎症信号通路的失调，主要表现为包括IRF7、IFI6、IFI27、IFIT1-5、IFI44和IFIH1等多种IFN响应基因和基因家族的上调表达，而间日疟原虫未感染的邻近肝细胞中，内源免疫反应通路上调，包括IFITM3蛋白上调。（姜小花）

间日疟原虫感染的单细胞肝图谱研究路线

A single-cell liver atlas of Plasmodium vivax infection.

2022.04.19, DOI: 10.1016/j.chom.2022.03.034

研究文章；消化系统疾病；人，肝脏，间日疟原虫，宿主-寄生虫相互作用，MPCC, Seq-Well, scRNA-seq；Liliana Mancio-Silva, Nil Gural, Alex K. Shalek, Sangeeta N. Bhatia; Massachusetts Institute of Technology (MIT), Ragon Institute of Massachusetts General Hospita, Broad Institute of MIT and Harvard, Howard Hughes Medical Institute, The Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering Harvard University Boston, Unitéde Biologie des Interactions Hôte-Parasite; USA, Paris.

肝基质细胞限制巨噬细胞成熟，基质IL-6限制肝硬化相关巨噬细胞的分化

Journal of Hepatology [IF: 25.083]

① 选取非肝硬化（n=7）和肝硬化（n=5）人肝组织，使用原代人基质-骨髓共培养系统，通过肝基质细胞和骨髓细胞的scRNA-seq转录组和细胞表型分析，来研究肝基质细胞如何影响CD14⁺细胞的成熟和分化，探究了肝脏基质细胞调控髓样细胞表型机制以及体外基质-髓样系统与研究人类肝硬化的相关性。

② 流式细胞术分析发现，肝基质细胞显著减少了CD14⁺单核细胞向巨噬细胞的转化，bulk RNA-seq进一步分析显示，基质细胞共培养的CD14⁺细胞，与血源性单核细胞（Mono1）和巨噬细胞簇具有转录相似性，为单核细胞和巨噬细胞的混合物，表明体外的原代肝基质细胞限制了单核细胞向巨噬细胞的成熟。

③ 体外transwell测定和基质细胞上清液转移技术评估发现，基质-髓系细胞与细胞间的接触是基质细胞降低HLA-DRhi表达和限制CD14⁺细胞成熟的主要机制。

④ 体外基质细胞和CD14⁺细胞的RNA-seq，结合体外肝脏scRNA-seq数据集，发现IL-6和IL-6R分别在肝基质细胞和CD14⁺细胞中表达，表明基质-髓系IL-6-IL-6R相互作用是控制巨噬细胞分化的一种合理机制。

⑤ 分析CD9⁺和CD163⁺细胞频率，发现每个供体中CD9⁺和CD163⁺细胞的频率相似，表证实了IL-6的产生是基质细胞限制SAM分化的一种机制。此外，与健康肝脏组织相比，早期人类肝病中局部IL-6水平降低，表明局部IL-6在健康肝脏中具有保护作用。（韩洞明）

试验设计及主要发现

Liver stromal cells restrict macrophage maturation and stromal IL-6 limits the differentiation of cirrhosis-linked macrophages.

2021.01.21, DOI: 10.1016/j.jhep.2021.12.036

研究文章；消化系统疾病；人，肝脏，肝硬化，巨噬细胞分化，骨髓细胞，基质细胞，scRNA-seq; Erica L. Buonomo, Shenglin Mei, Arlene H. Sharpe; Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital; USA.

多组学分析多灶性肝内胆管癌肿瘤异质性和免疫亚型

Clinical Cancer Research [IF: 13.801]

① 对16例多灶性肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）患者的66个肿瘤样本，通过全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）、bulk/scRNA-seq、甲基化芯片和多重免疫染色，全面地描述了多灶性ICC的基因组、转录组、表观基因组和免疫异质性的“景观”，提出了采用免疫分类法对患者预后进行分类的建议，有利于个性化免疫治疗。

② 将ICC患者分为高瘤间异质性（high intertumor heterogeneity，high-ITH）组和低瘤间异质性（low-ITH）组，发现两者在基因组、转录组和表观基因组方面存在广泛的异质性。

③ Bulk RNA-seq反卷积、多光谱成像和scRNA-seq分析揭示了ICC患者肿瘤的主要免疫细胞比例具有相对较低的异质性。

④ 基于已报道的免疫标记物的基因表达对所有66例肿瘤样本进行无监督层次聚类，识别到一种低免疫和一种高免疫细胞簇，与前者相比，高免疫簇中包含的肿瘤具有更高的免疫细胞浸润，更紧密的肿瘤-免疫细胞相互作用，并上调免疫通路相关基因。

⑤ 从上述两个细胞簇中筛选出CD8B和ICOS两个差异表达基因，发现它们的表达水平可用于区分高、低免疫细胞簇和预测患者预后；high-ITH组患者的预后优于low-ITH组，但差异不显著。

⑥ “免疫压力”（immune pressure）促使启动子DNA高甲基化，通过调控免疫基因的表达，来降低ICC中新抗原的表达。（大禹）

试验综合分析示意图

Multiomic analysis reveals comprehensive tumor heterogeneity and distinct immune subtypes in multifocal intrahepatic cholangiocarcinoma.

2022.05.02, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-21-1157

研究文章：消化系统疾病，癌症；人，肝脏，胆管，多灶性肝内胆管癌，免疫异质性，scRNA-seq; Shuling Chen, Yubin Xie, Yuhong Cai, Ming Kuang, Sui Peng；中山大学附属第一医院；中国

时空技术

Spatial-Temporal Technology

SEAM：研究组织微环境的单细胞核空间代谢组学方法

Nature Methods [IF: 28.547]

① 报道了一种空间单核代谢组学方法SEAM（Spatial single nuclEar metAboloMics），它结合空间分辨质谱成像和机器学习算法，只需要最少的样品制备和标记，便能够实现组织原位代谢异质性可视化、单细胞核图像识别、代谢特征信息提取，以及单细胞的聚类、差异化分析，提供组织中单细胞的“代谢指纹图谱”。

② 应用SEAM解析野生型小鼠肝脏组织中的空间代谢异质性，发现了肝细胞代谢异质性亚群，有效证明了SEAM的可靠性和准确性。

③ 采用SEAM对人肝纤维化中的代谢异质性进行空间代谢组和空间转录组联合分析，发现在肝纤维化样本中存在2种代谢差异的肝细胞亚群，它们具有与接近纤维化生态位相关的特殊代谢特征，这一发现也通过Geo-seq进行了验证。（庄雯）

SEAM在单细胞核分辨率下捕获肝脏的空间代谢异质性

SEAM is a spatial single nuclear metabolomics method for dissecting tissue microenvironment.

2021.10.04, DOI: 10.1038/s41592-021-01276-3

研究文章；时空技术；小鼠，肝脏，组织微环境，空间代谢组，snRNA-seq; Zhiyuan Yuan, Shao Li, Yang Chen, Tsinghua University.

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