Nat Neurosci | 单细胞转录组揭示人类胚胎脊髓发育

近日，斯坦福大学研究团队利用单细胞转录组技术揭示了人类妊娠中期胚胎脊髓发育的过程，发现了神经元、胶质细胞等细胞类型之间和细胞类型内的显著异质性。同时，该研究定位了脊髓中的疾病相关基因，构建了脊髓干细胞的疾病模型，为运动控制相关疾病提供分子基础。该文章于2023年4月在国际期刊Nature Neuroscience上发表，以下是文章的详细解读。

文章题目：Single-cell transcriptomic landscape of the developing human spinal cord

发表时间：2023-04-24

发表期刊：Nature Neuroscience

主要研究团队：斯坦福大学等

影响因子：25.000

DOI：10.1038/s41593-023-01311-w

研究背景

脊髓在整合感觉和运动信息以调节运动方面起着核心作用。了解脊髓的组成对于阐明运动行为如何受控以及疾病如何产生至关重要。但人类脊髓的组织结构非常复杂，这种复杂性是如何在人类脊髓的细胞水平上产生的，至今仍是个未知数。

研究样本

样本来源：斯坦福大学医学院（Stanford University School of Medicine）；

选择条件：选择性终止妊娠，去身份识别，孕17周（gestational week 17，GW17）和GW18；

样本数量：4；

样本类型（组织/器官）：脊髓。

研究成果

1. 发育中人类脊髓的转录组学特征可视化

研究团队使用单细胞测序技术分析了脊髓样本的单细胞和单细胞核，使用UMAP降维聚类单细胞数据，注释出了一组星形胶质细胞，分别分布于神经管腹侧（floor plate，FP）、顶板（roof plate，RP）和中板（midplate，MP），以及少突胶质细胞，包括少突胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPC）/少突胶质细胞（oligodendrocyte，oligo），和一组连接两个谱系的多能神经胶质祖细胞（multipotent glial progenitor cells，mGPC）。

单细胞数据还鉴定了一组在单核样本中含量丰富的神经元（图1c），以及包括内皮细胞（endothelial cells，ECs）、周细胞和血管软脑膜细胞（ericytes and vascular leptomeningeal cells，VLMCs）在内的血管细胞组、施旺细胞和包括小胶质细胞和单核细胞在内的免疫细胞（immune cells including microglia and monocytes，MG/immune，图1b-e）。

图1 人脊髓单细胞研究方法展示

2. OPC/oligo谱系中的拟时序分析揭示少突胶质细胞的推定起源和分化轨迹

在注释出的少突胶质细胞中，共分为OPC、循环OPCs、mGPCs，分化的少突胶质细胞前体（committed oligo precursors，COP）、新形成的少突胶质细胞(newly formed oligos，NFOL)、形成髓鞘的少突胶质细胞(myelin-forming oligos，MFOL)和成熟少突胶质细胞(mature oligos，MOL)等亚类（图2b）。

为了探索少突胶质细胞的发育过程，研究人员对此进行了RNA速率分析。拟时序分析揭示了少突胶质细胞的推定起源和分化轨迹，并将其分成了10个簇（图2c-d）。不同簇之间的差异表达基因分析可得NFOL和MFOL中富集的基因与轴突引导和迁移相关，而MFOL和MOL因髓鞘形成相关基因而富集。

图2 脊髓中胶质细胞的发育轨迹

3. 发育中人类脊髓的星形胶质细胞多样性

为了研究星形胶质细胞的异质性，研究人员对星形胶质细胞进行亚类分析（图3a-c）。研究发现了一组神经胶质祖细胞，对应了表达SOX9的心室区细胞以及背侧和腹侧的mGPC，但成熟的星形胶质细胞标记物AQP4和SPARCL1、循环细胞和一群基于活性依赖基因（如FOS、EGR1和ARC）表达被称为“active”的细胞的表达量都较低。

除此之外，该研究定义了9个星形胶质细胞亚类簇。第一个亚类对应背腹轴，表达背侧（PAX3和ZIC1）和腹侧相关基因（EPHA5和SEMA3A，图3d）；第二个亚类对应于白质和灰质星形胶质细胞,白质或纤维星形胶质细胞的特征在于CRYAB、ID3和GFAP9的高表达（图3e），灰质或原生质星形胶质细胞的特征在于氨基酸转运蛋白SLC7A10、内向整流钾通道KCNJ16、兴奋性氨基酸转运蛋白SLC1A2和谷氨酰胺合成酶GLUL的高表达。

星形胶质细胞在神经元功能的发育和维持中起着至关重要的作用，接下来研究绘制了与星形胶质细胞功能相关的基因，研究发现所有类型的星形胶质细胞都表达Na⁺–K⁺–ATP酶和钾通道，但不同星形胶质细胞亚型表达的通道蛋白类型不同。此外，虽然大多数星形胶质细胞对Ca2⁺具有高度渗透性，但背侧原生质星形胶质细胞则不然，它们特异性表达AMPA受体亚基GluA2。最后发现，原生质星形胶质细胞具有更高的神经递质转运基因表达（例如SLC1A2、SLC7A10和SLC6A9），表明它们在突触释放的神经递质清除中发挥更突出的作用（图3i）。

研究团队使用Network Analysis Toolkit for Multicellular Interactions(NATMI)网络分析工具进行了细胞间相互作用分析，发现腹侧纤维星形胶质细胞和MOL显示出最高的相互作用特异性，表明这两种细胞类型之间的相互作用可能在营养支持、细胞粘附和引导以及血脑屏障稳态中发挥作用。

图3 星形胶质细胞的异质性

4. 发育中人类脊髓的中线神经胶质和mGPCs多样性

研究接下来探讨了神经祖细胞的多样性，发现VZ区RP、FP和MP细胞存在差异表达，沿背腹轴显示出不同的表达域（图4a-b）。对FP和RP细胞的分析揭示了磷酸酶抑制剂PPP1R17（图4d）的表达，这是大脑皮层的中间祖细胞的标记物，具有人类特异性基因调控。免疫组织化学分析表明PPP1R17在一组FP和RP细胞中以及沿背侧和腹侧中线表达（图4e）。研究还发现了一类表达EGFR、OLIG2和ASCL1的神经祖细胞，具有同时分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜质。

图4 人类脊髓发育中的中线神经胶质细胞和mGPCs

5. 人类发育早期运动神经元多样性

研究人员还探索了神经元的多样性（图5a）。在神经元亚类中发现了包括谷氨酸能（Glut：SLC17A6）、氨基丁酸能和甘氨酸能（GABA和GABA/Glyc.：GAD1、GAD2、SLC32A1和SLC6A5)以及胆碱能（SLC5A7、SLC18A3和CHAT）神经元（图5e）。研究团队使用了标签转移方法将单细胞数据和小鼠脊髓细胞类型图谱进行比较，表明了存在不同类型的兴奋性、抑制性和胆碱能神经元，以及背侧、腹侧和中间类型。胆碱能神经元分为表达内脏运动神经元（motor neurons，MN）标记物（NOS1）和表达骨骼MNs标记物（RET和GFRA1）的两个亚类，骨骼MNs分为α和γ两个亚组，且展示了和小鼠数据的相似性（图5g-k），但也展示了人类特异性表达的信号。

图5 脊髓神经元的多样性

6. 疾病相关基因定位揭示基因之间的相互作用可能与发病机制有关

在注释了细胞多样性后，研究人员绘制了脊髓数据集中与疾病相关基因的表达。首先，研究关注与髓磷脂相关疾病的基因，包括脑白质营养不良和退行性白质疾病（图6a）。团队发现了一个在髓鞘少突胶质细胞或施旺细胞（PLP1、FA2H和GJC2）中特异性表达的基因亚组，以及在不同类型的星形胶质细胞（GJA1、GFAP 和 EDNRB）或小胶质细胞（CSF1R和TREM2）中表达的一个亚组，表明基因之间的相互作用可能与发病机制有关。研究人员同样关注了与Charcot-Marie-Tooth神经病相关的基因（CMT，图6b），发现了一组在OPC/oligo谱系或施旺细胞（MPZ和PMP22）、星形胶质细胞(FGD4)和小胶质细胞(EGR2)中表达的基因，以及普遍表达的基因（KIF1B和SBF2）。最后，研究人员绘制了与ALS相关基因的表达图谱，其特征是MN的选择性丢失（图6c）。

图6 脊髓疾病相关基因的定位与表达

7. 发育中人类脊髓数据集整合量化不同细胞类型与发育时间的关系

研究团队将单细胞数据和另外两个已发表的人类脊髓转录组数据集进行了整合，量化了每种细胞类型随发育时间的百分比。研究发现OPC/oligo随时间发育富集，而星形胶质的神经祖细胞比例降低（图7c-d）。在空间分布上，研究人员在OPC/oligo群中没有发现明确的区域特定分布；相反，在星形胶质细胞群中，与颈部和腰部区域相比，胸部区域的原生质星形胶质细胞比例较低。在MN分化研究中，发现早在GW8-10 MN就存在明显的α和γ特征，而这种分化在啮齿类的发育晚期才出现（E17.5），表明α和γ MN多样化发生在人类发育的相对早期胎儿阶段。

图7 人类脊髓发育数据集整合

 总结与展望 

单细胞转录组学技术实现了对整个中枢神经系统的细胞多样性的系统性分析。该研究为了对妊娠中期人类脊髓的细胞类型进行全面普查，进行了scRNA-seq和snRNA-seq，描述了这个阶段的神经胶质和神经元多样性，并指出胎儿早期α和γ微核的多样性。

此外，还将得到的数据与多个现有的跨越22周妊娠的发育中人类脊髓的数据集整合，以研究随时间推移的细胞多样性。对发育中人类脊髓进行的转录组学定位与疾病相关基因的定位一起为研究人类运动控制的细胞基础开辟了新途径，并为基于干细胞的人类疾病模型建立提供指引。

内容 | 朱宁远

审校 | 沙金

题图 | 彭卫

排版 | 小飞鱼

‍

系列导读

推荐阅读

联系我们

对时空组学或单细胞组学整体解决方案感兴趣的老师，可选择以下方式和我们联系，我们将及时为您进行详细的介绍：

1. 在公众号留言；

2. 发送信息至邮箱：

[e-mail]；

3. “阅读原文”查看文章。

让我知道你“在看”