误吸生物学标志物研究进展：从实验室到临床
误吸生物学标志物研究进展：从实验室到临床
误吸是口咽或胃内容物经声门进入下呼吸道的过程，可带来严重的后果，包括吸入性肺炎、下呼吸道异物吸入甚至导致呼吸衰竭、死亡等。随着年龄的增长，住院肺炎病例中吸入性肺炎的比例急剧增加。研究显示，老年社区获得性肺炎患者中有71%存在隐性误吸，老年脑梗死患者吸入性肺炎患病率达60%~90%[1]。误吸的临床诊断根据患者是否有明确的呛咳误吸病史、临床症状和体征、误吸相关危险因素及典型的胸部影像学表现等做出综合判断[2]。但缺乏误吸精准快速诊断方法使得大部分隐性误吸的患者得不到及时正确诊断，从而导致漏诊、误诊、不恰当治疗如广谱抗生素过度使用、耐药菌产生等弊端。生物学标志物是在正常生理状态、致病过程和对暴露或干预有一定反应时的可明确测量的物质[3]。在下呼吸道样本中检测到了正常生理状态下不存在的，随误吸进入下呼吸道的生物标志物，可以作为误吸的诊断标准。为提高对这一领域的认识、现将误吸和误吸生物学标志物综述如下。
一、误吸的机制和危害
健康人体在直立、清醒状态下很少发生误吸，这与抗误吸的天然防御措施：胃排空、声门闭合反射，咳嗽反射等密切相关。老年人由于吞咽反射的延迟或下降、气道防御功能受损等而极易发生误吸。根据误吸物的性质，可将误吸后引起的肺部并发症即吸入综合征分为三类：一类是由吸入无菌性胃内容物引起的肺部损伤，如Mendelson's综合症；一类为吸入含有定植菌的口咽部分泌物引起的肺部炎症[4]；还有如食物、脂质等异物误吸导致的肺部损伤归类于其他的吸入综合征。
误吸和肺部微生态及宿主炎症反应有复杂的相互作用。然而肺部低细菌负荷使得致病菌评估受背景微生物组影响大。Mayumi等[5]运用胃蛋白酶、脂多糖、盐酸等无菌成分构建了小鼠吸入性肺炎模型，反复吸入21~28 d后，小鼠肺泡壁增厚，肺泡腔中浸润大量嗜中性粒细胞和单核细胞，促炎性细胞因子水平明显升高。误吸物的成分(包括无菌成分和病原体)都与肺内微生物群落改变和宿主炎症反应紧密相关。
二、生物学标志物
1．胃蛋白酶：
胃蛋白酶是由主细胞以酶原形式释放、胃酸激活、裂解产生有活性的蛋白酶，是胃内容物反流进入食管、下呼吸道和肺部的生物标志物。Yadhavan等[6]在探索食管闭锁患者反流性误吸的非侵入性诊断方法研究中，在7.1%的呼出气冷凝物中和83%的唾液样品中检测到胃蛋白酶，且有反流性误吸症状的患者唾液胃蛋白酶水平显着升高，表明唾液胃蛋白酶有可能作为反流误吸的非侵入性标志物。Kelly等[7]在慢性呼吸道症状患者的误吸相关食管外反流疾病(AERD)患病率的研究中，在74%支气管镜检查患者和71%行气管切开术患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中检测出胃蛋白酶，而所有无肺部疾病史患者检测均为阴性。胃蛋白酶检测的ROC曲线下的面积为0.86，证实了BALF中的胃蛋白酶可以作为AERD的标志。
胃蛋白酶的检测基于2个独立的原理，即酶活性和抗原特性。然而胃蛋白酶活性受PH影响，碱性的样本条件，如中耳液等，会降低测定灵敏度。另外，肺组织会产生有酶活性的胃蛋白酶C[8]，非特异性检测会产生假阳性结果，需证实样品中的胃蛋白酶来源于胃反流物。Hallal等[9]对34例重症监护室的患者气管分泌物应用蛋白质印迹技术分别检测了胃蛋白酶A和胃蛋白酶C，所有样品中均发现了胃蛋白酶A，76.5%的样品中检测到了胃蛋白酶C。
胃蛋白酶检测技术诊断误吸尚未转化为临床应用，还存在许多局限性。首先，没有误吸诊断的"金标准"进行对照；其次，最佳的采样时间不清楚，而且是否存在独立于时间点的其他因素影响检测结果也需要进一步验证。再次，健康人样本中也可检出胃蛋白酶，睡眠过程中食管上括约肌张力降低，胃内容物反流进入口咽部并随呼吸进入呼吸道，需进一步研究确定无症状者胃蛋白酶的范围、区分可容许生理状态和病理状态的检测值。
2．α-淀粉酶：
健康人群中，α-淀粉酶来源于胰腺，唾液腺和胃肠道，且不易穿过血液肺泡屏障。当患者发生了口腔分泌物的误吸，其肺部可检测到α-淀粉酶。在一项前瞻性研究中，Samanta等[10]对280例临床疑似呼吸机相关性肺炎患者，收集了其气管插管后72 h内的BALF，进行α-淀粉酶水平的测定，存在0、1、2和3个插管前误吸危险因素的α-淀粉酶水平依次递增。α-淀粉酶可作为插管患者口咽部误吸的有效标志，早期筛查误吸，指导可能发生误吸患者的管理。因α-淀粉酶在气管、声门下和口咽采集的样本浓度逐渐增加，也有研究提出将气管与口咽部样本α-淀粉酶值的比值作为吸入程度的指标，比率范围从5.5%到7.0%[11]。
α-淀粉酶检测方法有多种，其中分光光度法是研究中最常用的方法。在人体主要存在两种亚型：唾液淀粉酶(S型)和胰淀粉酶(P型)，可通过检测样品中总淀粉酶和胰淀粉酶，计算两者的差值得到唾液淀粉酶水平，也可用生化分析仪直接检测总α-淀粉酶。由于样本量和测量频率差异很大，评估误吸临界值不同，缺乏统一标准。Sole等[12]将实验室方法检测到样品中的α-淀粉酶即视为发生了误吸。Millot等[13]基于敏感性和特异性的考虑当α-淀粉酶检出值高于1 685 U/L时提示误吸。还有研究将检测水平高于临界值的样品数占该患者总样品数的百分比大于特定数值(如30%)的患者视为误吸[14]。
α-淀粉酶检测作为误吸诊断的临床意义尚不明确，Weiss等[15]的研究表明α-淀粉酶水平与细菌性肺炎有关联，但与样品中α-淀粉酶浓度相比，口腔或上消化道分泌物中的细菌定植可能是肺部感染的主要致病因素。α-淀粉酶具有易于分析，价格低廉，检测窗口相对较长(最长可达72 h)的优点。下气道样本中的胃蛋白酶和α-淀粉酶反映了不同来源的误吸，两者联合检测可能会提高误吸诊断的灵敏度。
3．胆汁酸：
胆汁酸由肝脏合成，胆囊储存，进食时释放到小肠。在发生误吸的胃十二指肠返流患者的唾液和BALF中可检测到胆汁酸。在碱性的肺泡液中胆汁酸呈高度溶解和活性形式，可能通过破坏肺表面活性物质，直接损伤Ⅱ型肺泡细胞或者改变肺部微生物群落组成等方式，促进炎症的发生发展。Andreacarola等[16]在量化慢性同种异体肺移植功能障碍(CLAD)十二指肠-胃-食管反流性误吸的研究中发现，BALF中较高的胆汁酸水平是CLAD死亡率和细菌感染的独立预测因子，阐明了胆汁酸吸入机制，并提出了高胆汁酸水平与阳性细菌培养增加具有相关性。Andreacarola等[17]的体外研究也发现了胆汁酸通过毒蕈碱M3受体介导，对人类和啮齿动物的近端和外周气道的胆碱能收缩有急性抑制作用，并且推测胆汁酸的误吸可能会影响肺的先天防御，影响其清除支气管分泌物的功能。
胆汁酸检测技术主要有分光光度法、酶试剂盒法、色谱-质谱法、生物传感器等。在胆汁酸水平低于5 μmol/L时，酶法灵敏度低，可能与胆汁酸相似的代谢物发生的交叉反应，出现假阳性或假阴性结果。Zhang等[18]在GERD患者的BALF中运用色谱-质谱法检测了三种胃反流液中含量丰富的胆汁酸：牛磺胆酸，甘氨胆酸和胆酸。色谱-质谱法测量准确且可量化分析多种类型胆汁酸的浓度，但操作复杂、成本高、分析时间较长。开发床旁检测胆汁酸的简易方法是未来研究的方向。
因下气道样品中的胆汁酸仅代表十二指肠反流引起的误吸，58%非GERD患者和75%~86%的GERD的患者会出现十二指肠反流，单独测量胆汁酸可能低估了误吸的发生率，研究多联合检测胃蛋白酶和胆汁酸来评估患者的误吸风险。因胆汁酸通常会严重损伤误吸患者的呼吸道，导致不良临床后果，其检测对吸入综合征的治疗和预后具有意义。
4．其他标志物：
在下呼吸道样本检测到消化道或口咽分泌物的成分可以直观展现误吸过程，诊断误吸有说服力，而其他标志物在辅助诊断吸入综合征上更具价值。可溶性髓系细胞触发受体(sTREM)-1在吞噬细胞上表达，是细菌感染的可靠标志。当发生细菌和真菌感染时，sTREM-1在皮肤、生物体液和组织中高度增加[19]，且微生物密度与sTREM-1的水平之间也存在显著的相关性，但在非感染性炎症条件下不增加，sTREM-1对于鉴别感染性与非感染性的吸入综合征有潜在价值。Paul等[20]通过向大鼠气管内滴注盐酸、非酸性胃小颗粒(SNAP)或酸和小颗粒联合(CASP)建立大鼠误吸模型，分析了BALF的细胞因子谱，发现与其他形式的抽吸相比，在吸入CASP的BALF中，肿瘤坏死因子(TNF)-α水平大大降低，而白细胞介素(IL)-1β，中性粒细胞趋化因子(CINC)-1、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和IL-10的水平显著增加，展现了细胞因子谱在鉴别误吸物类型上的潜力。
pH监测法受取材部位和监测时间影响[21]，缺乏证实其诊断误吸灵敏度特异度的相关研究。载脂巨噬细胞检测影响因素较多，仅适用于脂质误吸。此外，表面活性蛋白A(SP-A)和D(SP-D)[22](通过抗感染和免疫调节作用维持肺部稳态)、物质P[23](介导咽黏膜局部刺激反应并增强吞咽和咳嗽反射)、弹性蛋白降解产物[24]等是否可用于误吸标志物有待进一步研究。
三、挑战和展望
近十年来，国内外研究者开展了大量误吸生物学标志物的研究，并取得了一定的进展。但从这些研究中也可发现亟待解决的问题：(1)缺乏标准化流程：样品采集的时间、样品量和采集频率等；(2)无法标准化浓度。采样时的稀释度，误吸频率、剂量或肺部自身清除能力等都会影响样本中标志物的浓度；(3)诊断临界值尚未统一。
准确检测误吸发生的时点、识别不同误吸源，明确误吸与炎症的关联对于指导临床治疗，尤其对于误吸高危的老年人具有重要意义。未来研究可通过联合检测多种技术指标来提高诊断的特异度，并通过标志物种类区分误吸物来源，以便采取针对性的干预措施预防吸入性综合征，改善不良预后。目前如纤维鼻咽喉镜吞咽功能检查、放射性核素唾液图、动态核磁等方法都对误吸的诊断有帮助。此外，近年来组学技术飞速发展，将组学技术与生物学标志物检测结合起来也是诊断误吸、研究误吸与吸入综合征机制的新思路。
引用: 时铭蔚, 王立娜, 魏珊辰, 等. 误吸生物学标志物研究进展：从实验室到临床 [J] . 中华老年医学杂志, 2022, 41(8) : 1007-1010.