中国科学院过程工程研究所张贵锋教授研究团队：明胶中纤连蛋白结合肽的鉴定和表征 | MDPI Polymers
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文章导读
胶原蛋白和纤连蛋白 (Fibronectin, FN) 是细胞外基质 (Extracellular Matrix, ECM) 中的重要成分，胶原-FN 在调节细胞行为中起着关键作用。在本研究中，作者使用亲和层析法从明胶 (降解的胶原蛋白) 中分离 FN 结合肽，并使用 HPLC-MS 确定其氨基酸序列，结果显示所有 FN 结合肽都含有 GPAG 或 GPPG；作者使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) 和双偏振干涉仪 (Dual-Polarization Interferometry, DPI) 分析了羟基化多肽对 FN 结合活性的影响，研究表明分子量在 FN 与肽的相互作用中起到重要作用；作者通过 MALDI-TOF MS 分析了两种除了脯氨酸羟基化外具有相似序列的肽，研究发现羟基化修饰的位置和数量对 FN 结合强度起关键作用。
研究过程
由于 FN 与明胶存在亲和力，明胶中的肽会被亲和层析分离。图 1 表明，只有少数含有特属序列的肽能与 FN 的 N 端结合。图 2 中分离的多肽分子量主要的峰分布在 6~8 ml，是一些具有较大分子量的多肽。
图 1. 明胶中分离肽的亲和层析。
图 2. 脱盐肽部分的凝胶过滤色谱图。
图 3 和图 4 的 MALDI-TOF MS 质谱显示，两个样品的截留分子量范围为 1000~6000 Da，但要分布在 2000~3000 Da 之间。
图 3. 样品 1 的 MALDI-TOF MS 质谱图。
图 4. 样品 2 的 MALDI-TOF MS 质谱图。
作者使用 HPLC-MS 分析了牛明胶、分离的明胶 (未消化)、样品 1 和样品 2。图 5A、B 中谱峰的相似性表明，明胶含有许多可与 FN 结合的肽类；与图 5B~D 相反，图 5C、D 的保留时间比图 5B 短很多，这进一步表明明胶中较大的肽被降解为了较小的肽。同时作者对图 5C、D 所示的质谱进行了数据库检索和软件分析，见表 1。
图 5. 牛明胶在 37 ℃ 下消化 12 小时后的总离子流色谱图。(A) 牛明胶；(B) 样品 1 被消化前的分离明胶；(C) 样品 1；(D) 样本 2。
表 1. 通过数据库搜索并确定样品 1 和 2 中的肽。
图 6 的离子色谱图和图 7 与序列 GAN-GAP*GIAGAP*GFP*GAR 对应的 MS/MS 谱进一步表明，GPAG 或 GPPG 是 FN 的结合部位，这也是关于表 1 中部分序列以及它们与 FN 结合的首次报告。例如序列 GFSGLDGAK 对应于 m/z 851.4，匹配的 b 和 y 离子色谱如图 8 所示。
图 6. 表 1 中编号 1~4 肽提取的离子色谱图。(A) m/z 796.8；(B) m/z 1042.3；(C) m/z 908.9；(D) m/z 780.9。
图 7. 与序列 GAN-GAP*GIAGAP*GFP*GAR 对应的 m/z 793.6 的 MS/MS 谱图 (“*”表示脯氨酸的羟基化修饰)。
图 8. 与序列 GFSGLDGAK 对应的 m/z 851.4 的 MS/MS 谱图。
将 1 (图 9)、3 (图 10) 和 10 (图 11) kDa 的肽和牛明胶分别注入 DPI 的两个通道中，并与固定在芯片上的 FN 反应。对比发现，分子量在 FN 与肽的相互作用中起到重要作用。在本文中，2~30 kDa 范围内的多肽对 FN 表现出更好的亲和力。
图 9. 1 kDa 样品对芯片表面固定化 FN 的吸附。(A) 测量的 TM (黑线) 和 TE (红线) 相变；(B) 解析的层厚度 (黑线) 和质量 (红线)。
图 10. 3 kDa 样品对芯片表面固定化 FN 的吸附。
图 11. 10 kDa 样品对芯片表面固定化 FN 的吸附。
表 2 列出了四个合成肽的序列和 MW，其中肽 1 和 2 以及肽 3 和 4 分别以 1:1 的质量比混合，作者分别将其命名为 GIA 和 GPP，以此来研究羟基化修饰对 FN 结合的影响。图 12 和 13 结果显示，FN 结合特性较依赖于脯氨酸羟基化的位置与数量。
表 2. 四种合成的多肽的序列和分子量。
图 12. (A) GIA 样品和 (B) 洗脱液的 MALDI-TOF MS 谱图。
图 13. (A) GPP 样品和 (B) 洗脱液的 MALDI-TOF M S谱图。
研究结论
// 作者采用亲和层析法分离可与 FN 结合的多肽，并通过 HPLC-MS 确定多肽的氨基酸序列。
// MALDI-TOF MS 和 DPI 用于分析多肽的 MW 和羟基化修饰对 FN 结合活性的影响。研究发现，能与 FN 结合的肽序列均含有 GPAG 或 GPPG，可被视为 FN 结合肽的核心序列，这些肽的 MW 主要分布在 100~2000 Da 范围内。
// DPI 用于测量固定化 FN 的芯片上具有不同 MW 范围的肽的吸附厚度和质量，MW 范围在 FN 和肽之间的相互作用中起着重要作用。
// MALDI-TOF MS 用于测量羟基化修饰对 FN 结合的影响，研究发现羟基化修饰的位置和数量对结合强度起着关键作用。
// 本文利用生物酶水解技术降解明胶，并结合质谱分析，在分子水平上鉴定了多肽中 FN 结合的核心序列。肽序列的 FN 结合域缩短，为新原料的开发提供了策略，为功能食品的功能因子研究提供了依据。
// 本文首次利用 DPI 和 MALDI-TOF MS 在线分析多肽与 FN 的动态结合过程，探讨了各种因素对结合的影响。研究结果提供了一种新的分析技术方法，也为研究多肽与 FN 的结合特性提供了理论依据。
研究 FN 与胶原蛋白降解物之间的相互作用，对于深入探索血栓形成、凝血过程、免疫条件以及不同生理条件下胶原蛋白降解对人体健康的影响具有重要重要意义，本文为相关研究提供了技术参考。
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原文出自 Polymers 期刊
Liu, Y.; Gao, J.; Liu, L.; Kang, J.; Luo, X.; Kong, Y.; Zhang, G. Identification and Characterization of Fibronectin-Binding Peptides in Gelatin. Polymers 2022, 14, 3757.
Polymers 期刊介绍
主编：
Alexander Böker, University of Potsdam, Germany
期刊主题涉及聚合物化学、聚合物分析与表征、高分子物理与理论、聚合物加工、聚合物应用、生物大分子、生物基和生物可降解聚合物、循环和绿色聚合物科学、聚合物胶体、聚合物膜和聚合物复合材料等研究领域。
2021 Impact Factor | 4.967 |
2021 CiteScore | 5.7 |
Time to First Decision | 13 Days |
Time to Publication | 31 Days |
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