细菌脓毒症病理学的昼夜节律：我们知道什么和应该知道什么
”急重症世界翻译组“出品，作者：
陶惠译，刘岗校
苏州工业园区星海医院
摘要脓毒症是一种由宿主对感染的反应失调引起的综合征，是感染致死的主要原因。在动物模型中，死亡率强烈依赖于脓毒症开始的时间，提示昼夜节律系统起着主要作用。在脓毒症治疗的患者中，也有昼夜节律失调的报道。这里，我们回顾与脓毒症开始时间相关的数据，以进一步了解患者和动物模型中观察到的不同预后。免疫激活的程度、低体温反应与预后最差的时相相关。不同的预后似乎取决于时钟基因Bmal1在肝脏和髓系免疫细胞中的表达。了解昼夜节律系统在脓毒症病理中的作用可能是改善患者治疗的重要工具。
关键词：脓毒症、昼夜节律、免疫系统、低体温、感染
脓毒症是一种宿主对病原体反应失调引起的以多器官功能障碍为特征的综合征，是感染致死的主要原因，每年全球超过3000多万人受累，住院死亡率约为25-40%。脓毒症症状因感染部位、侵入性微生物类型、既往患者健康状况和检测时间而异；包括：体温改变（发烧或低温）、心率和呼吸频率升高、精神状态改变、糖代谢、炎症和血流动力学改变等。脓毒症休克定义为因代谢和循环改变而恶化了的脓毒症，即低血压，而低血压增加死亡率。存活的患者可能会出现长期的生理、心理和认知障碍。尽管脓毒症休克很严重，但没有有效的疗法可以显著降低死亡率和致残率。
病原体感染触发重要的炎症反应，诱导促炎细胞因子（如IL-6、IL-1和TNF-α）释放增加，称为“细胞因子风暴”，产生并不局限于感染部位的全身炎症反应（SIRS）。IL-6增加诱导肝脏中C反应蛋白的产生，这是一种具有抗凝和抗凋亡功能的急性反应蛋白，可用作潜在的脓毒症生物标志物预测因子。此外，还引起抗炎反应，引起包括糖皮质激素、IL-10、IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）和TGF-b的分泌。过度的炎症可能导致组织损伤，而过度的抗炎反应可能有利于继发性感染。IL-10水平与最差患者预后相关。
与其他病变一样，中枢神经系统参与脓毒症的发生，表现为中枢神经组织中促炎分子的增加。迷走神经激活触发乙酰胆碱（主要的迷走神经递质之一）的产生，乙酰胆碱抑制巨噬细胞合成和释放免疫介质（如TNF-α），从而延长脓毒症小鼠的寿命。此外，免疫反应激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，最终导致糖皮质激素分泌，从而调节多种身体功能，如肝糖异生、葡萄糖摄取、免疫功能等。最后，促炎反应可以改变血脑屏障（BBB），增加其通透性，并允许细胞因子和白细胞进入。
脓毒症和脓毒症休克的动物模型
研究最多的脓毒症动物模型之一是通过给予高剂量（接近20 mg/kg）的细菌内毒素脂多糖（LPS），导致高死亡率和脓毒症的特征性体征。这是一项简单且可重复性的技术，其剂量依赖效应取决于所使用的细菌和小鼠品系。
给予活菌是一种简单、可重复的和低创伤性的方法，用于研究对特定病原体的反应，无需手术。这种技术可用以模拟医院感染，而院内感染通常由单一感染引起的。
盲肠结扎穿孔术（CLP）被认为是人类阑尾破裂或憩室炎穿孔的模型。由中线剖腹、盲肠外置结扎、结扎盲肠穿孔等方法诱导。反应的严重程度可以通过穿孔的大小和数量调整。
脓毒症动物模型的昼夜节律变化
脓毒症休克引起的死亡率存在日变化：小鼠在其活动静止期结束时（即一天结束时）腹腔注射高剂量LPS，其死亡率（约80%）高于在活动活跃期中期（深夜）注射时（约30%）。静脉注射TNF-a结果类似。而且，如果活动期（夜间）感染，肠沙门氏菌的清除率更高。此外，与静止期中期（白天）相比，CLP引起的脓毒症在活动期结束时（夜间）手术其预后更差。不同模型间预后不良时间的差异可能与各种刺激方法的动力学差异有关。
对脓毒症与分子生物钟机制之间的关系进行了研究。生物钟的分子机制来自于负转录反馈环。核心环包括正性元素时钟和Bmal1，诱导负性元素PER1-3和Cry1-2的表达，进而抑制正性元素产生周期接近24小时振荡的转录活性。研究表明，PER2（PER2 KO）缺陷小鼠对LPS诱导的脓毒症休克有更强的抵抗力，表现出较低的IFN-g、IL-1b水平和较高的糖皮质激素水平。有许多研究表明，生物钟基因的振荡在这些小鼠中被破坏。此外，在LPS注射后，它们还表现出时钟基因时钟和Bmal1以及参与肾上腺糖皮质激素合成的酶Star的mRNA表达增加。同样，时钟缺陷小鼠在CLP诱导的脓毒症后有更高的存活率。此外，两种突变体的死亡率无每日差异。因此，提示肾上腺外周时钟可能通过调节酶Star在调节LPS-皮质激素分泌的时间上发挥重要作用。总而言之，这些数据表明，观察到的每日死亡率差异取决于时钟的功能，而不是特定的时钟成分，因为PER2 KO小鼠表现出更高的时钟水平，而且两种突变动物比WT小鼠对脓毒症的抵抗力更强。
免疫介导的昼夜节律调节
我们最近报道，静止期结束时LPS诱导的脓毒症比活动期接种的动物产生更高水平的TNF-AIN。此外，TNFR1缺陷的小鼠不仅存活率更高，而且还消除了每日差异。此外，还观察到，在通过CLP诱导的脓毒症中，缺乏Toll样受体（TLR）-2的小鼠死亡率的昼夜节律变化消失。
巨噬细胞在脓毒症的所有阶段都起着至关重要的作用。腹腔巨噬细胞是腹腔刺激后最先被激活的巨噬细胞，根据其表型和功能可分为大细胞、小细胞、LPMs和SPMs。SPMs和LPMs具有特殊的功能：SPMs呈现促炎功能特征，而LPMs似乎在维持腹腔生理功能方面起作用。在非刺激条件下，LPMs是最丰富的巨噬细胞亚群，而SPM是次丰富亚群。然而，作为对感染或炎症刺激的反应，腹腔的细胞成分会发生改变。尽管关于SPMs和LPM细胞刺激诱导的功能特征的信息相对较少，但数据显示，这两种细胞类型都可以根据刺激分化为M1（经典激活、促炎）和M2（替代激活、抗炎）细胞。此外，免疫刺激诱导LPMs水平下降，这种现象被称为巨噬细胞消失反应（MDR），可包括细胞凋亡、局部凝块形成和迁移。这些细胞聚集在网膜中，并能与间皮细胞相互作用。有趣的是，死亡率较高时（在静止期末期）给予LPS，这一现象更为明显。作为对肝脏的无菌损伤，通过直接募集跨间皮的方式侵袭受累的组织。对此，最近发现Bmal1在肝细胞中的条件性缺失（Bmal1DHep）导致了结构性的高LPS敏感性，表明肝脏信号可以以时钟依赖的方式诱导LPMs。
LPMs水平的下降伴随着炎性单核细胞的增高，炎性单核细胞可分化为SPMs，在LPS刺激2天后SPMs增加。这些细胞在静止期结束时有更高的水平。体外研究表明，SPMs在LPS的作用下形成促炎特征，提示与此时观察到的较高水平的TNF-α相关。
LPS诱导的脾巨噬细胞也被激活（通过CD86表达证实）。有趣的是，在静止期注射LPS后，脾巨噬细胞激活增加，但在活跃期不增加。
最近的研究表明，髓系细胞中Bmal1的条件性缺失（Bmal1ΔMye）扰乱了巨噬细胞的时钟，加速了CLP或rLPS诱导的脓毒症死亡，并消除了死亡率的每日差异。Bmal1ΔMye鼠有更高的促炎反应和致炎反应。病原体与宿主免疫系统之间的相互作用非常复杂，包括两个阶段：以过度炎症为特征的早期阶段和以持续免疫抑制为特征的晚期阶段。因此，发现Bmal1与促炎和抗炎过程有关也就不足为奇了，两者在脓毒症时都均失调。相反，在Bmal1ΔMye鼠中，在有时间限制的喂养时，接种LPS后的每日差异并未消除。这种差异可能是由于两种模型中观察到的脓毒症诱导死亡的动力学不同所致，因为最后提到的研究中Bmal1ΔMye鼠存活时间较短。此外，只在夜间喂养的小鼠可能有更强的外周昼夜节律，这可能会弥补髓系细胞中Bmal1的缺乏，类似于同一过程中呼吸交换率的节律所发生的情况。
关于抗炎机制，血清IL-10和皮质酮水平在注射LPS后升高，没有时差。动物模型中已证明，刺激HPA轴（负责糖皮质激素分泌）增加了对内毒素休克的抵抗。然而，糖皮质激素的临床治疗并不总能延长生存期，并可产生治疗耐受。此外，参与昼夜节律调节的褪黑素具有抗炎特性，对脓毒症引起的心脏、肺、肝脏和肾功能障碍有保护作用。这些效应可能依赖于褪黑素受体诱导的中性粒细胞活性。
这一证据可能表明，在脓毒症期间改变的某些生理功能（如免疫系统的昼夜节律控制）可能在该综合征的发病机制中起重要作用。
脓毒症时体温的昼夜节律调节
如前所述，脓毒症的另一个特征是体温改变：发烧或低体温，低体温与更差的预后和更高的炎症有关。有趣的是，无论是CLP还是LPS诱导的脓毒症中，较深的低温与较高的死亡率（分别是活跃期和静止期末期）相关。
下丘脑视前区（POA）是热调节的主要整合脑区，但视交叉上核（SCN）和室旁核（PVN）也调节热信号。LPS接种后诱导这些脑区的神经元激活。有趣的是，在死亡率较高的时（静止期结束时）接种LPS后这种激活（通过CFOS表达来衡量）增加。TNFα和TNFR1都参与免疫昼夜节律调节和对LPS的低温反应。已证明，脓毒症休克时POA可诱导这些分子，尽管它与LPS接种的时间无关。
对外周振荡器而言，温度是众所周知的昼夜节律改变的信号。研究表明，与核心温度节律相似，温度昼夜节律的变化可以改变和增强外围昼夜节律的振幅。此外，生物钟负责体温昼夜节律，因此在脓毒症期间，这种双向作用被破坏。
昼夜节律系统在代谢和循环改变中的作用
代谢或循环功能与生物钟之间有许多相互作用。如前所述，脓毒症患者可通过诱导糖酵解发生低血糖，如果不通过肝脏糖异生代偿，可能会致命。采用限时喂养方案，LPS诱导的低血糖与较高的死亡率相关（静止期结束），而此时诱导NLRP3炎症小体的β-羟丁酸水平升高。这种炎性小体，以及活性氧和氮物种和NF-kB通路均可在线粒体中被时钟基因和褪黑激素调控。
生物钟还调节凝血和纤溶过程。Bmal1缺陷小鼠表现出高凝状态和动/静脉血栓形成增强。此外，Bmal1的缺失会引起凝血因子水平的改变，从而导致口腔链球菌感染时的凝血功能异常。此外，参与凝血和脂多糖诱导的炎症和死亡的组织因子（TF）在肝脏中受昼夜节律性调节。
尽管有这些数据，但在一天中的不同时间诱导脓毒症时，这些机制发生了什么，以及在病理过程中它们的昼夜节律如何变化，仍然有待探索。
脓毒症时昼夜节律失同步化
不同方案（SCN损伤或慢性时差模型）实现的昼夜节律的失同步增加了LPS诱导的炎症，而恒定光照条件（也具有破坏性）降低了CLP后的存活率。有趣的是，在失同步化小鼠中，死亡率和低温反应的恶化伴随着TNF-α水平的增加。同样，4次颠倒的LD周期（每周1次）增加了死亡率。此外，我们小组的其他研究表明，在持续的黑暗条件下，对LPS反应的每日差异消失，存活率始终较低。这表明，时间外部线索缺失以及失同步化可以降低脓毒症患者的存活率。这些数据还支持免疫系统和昼夜节律系统之间的双向影响，并表明中枢时钟对免疫刺激的敏感性的强烈影响。
此外，与活动期喂养小鼠相比，反向喂养（仅在静止期喂养）诱导的中枢和外周时钟解耦联也增加了CLP后的死亡率，并加剧了炎症反应。有趣的是，反向喂养逆转了LPS接种诱导的更高死亡率的时间。此外，Bmal1DHep鼠以法尼醇X受体（FXR）依赖的方式发展出不受光照或喂养时间表影响的结构性高LPS敏感性。
昼夜节律系统对患者反应的影响
就患者而言，研究表明，与（当天）活跃期开始时相比，在（当天）活跃期末期接种牛种布氏杆菌可诱导更高水平的血清皮质醇。此外，健康志愿者对内毒素血症的急性期反应存在昼夜差异，在静止期（夜间）有更明显的炎症反应。此外，脓毒症患者的细胞因子水平比重症监护病房（ICU）其他患者更高，并表现出时钟基因节律的几个改变。伴随这些改变的是与时序紊乱有关的尿中6-硫氧基黑素（aMT6s）排泄量的增加。一项纵向研究报告称，与ICU入住和离开时相比，ICU期间脓毒症休克患者的aMT6s升高，皮质醇水平降低。此外，较高的aMT6s或皮质醇平均值与较低的住院死亡率相关。在遭受严重创伤的患者中进行的研究表明，皮质醇节律的早期改变与脓毒症的发生有关。这些参数伴随时钟基因和白细胞计数的改变。然而，在非脓毒症ICU患者中也观察到时钟基因表达和静止期活动节律的变化。由于睡眠剥夺会增加炎症反应，考虑到ICU通常有恒定的光照，这可能会使炎症反应复杂化。
由于脓毒症与昼夜节律的相关性，已提出时间生物学疗法。由于脓毒症的ICU患者出现了昼夜节律和睡眠的改变，几项研究尝试使用光疗法来重建昼夜节律。在脓毒症动物中，亮蓝光照射可增强细菌的清除，减少全身炎症和器官损伤。然而，尽管这些工作使用的是低强度的光，但光疗法并没有改善患者的预后。如前所述，褪黑素在脓毒症中显示出抗炎特性。此外，褪黑素降低了活跃期内毒素血症患者模型中IL-1β和YKL-40的血浆水平和氧化应激反应，但在静止期没有降低。
尽管有大量证据表明脓毒症反应具有昼夜节律成分，但导致这种差异反应的原因仍不清楚。图1总结了可以解释不同时间脓毒症诱导后不同结果的主要发现。免疫刺激在死亡率较高时（静止期结束时）诱导较高的细胞因子分泌，这些细胞因子可由SPMs或脾巨噬细胞等细胞分泌。而且，MDR在预后不良时（静息期结束）较高。在死亡率较高时，肝脏的昼夜节律可能与糖代谢改变和急性期蛋白分泌（包括促炎细胞因子）的增加有关。此外，控制体温的脑区的激活以及随后的体温过低，也与预后不良（静止期结束）有关。最后，糖皮质激素和IL10这两种抗炎介质的水平在不同的时间也有类似的升高。神经系统，特别是HPA轴和自主神经，调节着其中的许多功能。进一步了解脓毒症预后每日差异的原因，将有助于加深对在特定时间诱导更高的促炎免疫反应的机制的认识，并分析神经系统和肝脏在一天中每个时间段的作用。
（Time of highest sensitivity 最高灵敏度时间；Time of highest sensitivity 最低灵敏度时间；Hypothermia 低温；Autonomic nerve 自主神经；Pro-inflammatory cytokines 促炎细胞因子；Glucose 葡萄糖；Stimulus 刺激；Glucocorticoids 糖皮质激素；Vogus nerve 迷走神经）
图1. 在高死亡率和低死亡率时观察到的差异特征。感染性刺激影响肝脏和脾脏的腹腔巨噬细胞（SPMs和LPMs），在病重时其向血液中分泌较高水平的细胞因子。这种差异可能与刺激后较高的基础SPMs计数和较高的（CD86）脾巨噬细胞计数有关。在预后最差时，LPMs计数（MDR）会下降，但绝对值仍较高。抗炎介质糖皮质激素和IL10在两个时间段均有相似的升高。血糖的下降和β-羟丁酸（BHB）水平的升高在病重时更为明显，并取决于肝脏的节律。预后不良时，控制体温的脑区（POA、SCN和PVN）的神经元（cFos）激活以及随后的低温也增加。脓毒症时中枢神经系统与周围组织之间的通信通路包括HPA轴和自主神经（特别是迷走神经）。血脑屏障（BBB）可以接收炎症信号，并分泌细胞因子到脑内。此外，脓毒症期间的炎症会扰乱血脑屏障，增加其通透性。时钟基因Bmal1在肝脏和髓样细胞中的表达与较好的预后相关。
了解生物钟在ICU患者（特别是在感染或严重创伤后）中的作用，有助于改进脓毒症的治疗。此外，昼夜节律评估有助于判断预后。对此，在疾病早期，在一天中的不同时间测量节律变量（如免疫细胞计数、褪黑激素或皮质醇），有助于将昼夜节律与患者预后联系起来。同样，分析感染时间（例如在遭受严重创伤的个体中），将使我们能够评估在动物模型中观察到的昼夜节律差异是否可以适用于人类。
来源：Front. Cell. Infect. Microbiol. 11:773181.
doi: 10.3389/fcimb.2021.773181
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