Sci Adv︱巫林平/孙家明/陈国强团队制备有机水凝胶解决小直径血管移植物修复缺损问题

撰文︱侯金飞

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

心血管疾病是(Cardiovascular disease，CVD)危害人类的主要疾病之一，对于血管缺损的治疗，目前临床金标准仍然是血管移植[1]。组织工程血管因无供区损伤、生物相容性良好等优势，在临床上拥有极大的应用前景，其中小直径（2~6 mm）血管移植物是目前的研究难点：主要问题是其在体内不稳定易导致长期移植后血栓形成或血管破裂[2]。水凝胶因其生物相容性良好等优点常应用于组织工程血管的构建，但是水凝胶存在体液条件下长时间会出现溶胀和疲劳的问题，因此如何制备出机械性能良好、可在体内保持稳定的水凝胶血管是目前血管再生中的难题[3,4]。

2022年7月29日，广州中国科学院生物医药与健康研究院巫林平研究员课题组、武汉协和医院的孙家明教授团队和清华大学陈国强教授团队合作在Science Advances上发表了题为“Amphiphilic and fatigue-resistant organohydrogels for small-diameter vascular grafts”的研究。该研究制备了一种具备双亲性和抗疲劳性的有机水凝胶，该有机水凝胶主要由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶与聚羟基脂肪酸（PHA）及混入石墨炔（GDY）纳米颗粒制备出PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶；以该抗疲劳双亲性有机水凝胶为材料制备出凝胶血管，探索其修复血管缺损和促进血管再生的效果。

水凝胶被广泛用于组织工程、药物释放、干细胞治疗和癌症治疗等多个生物医药领域[5]。但是，水凝胶作为生物材料应用于组织修复方面存在着以下问题：（1）水凝胶易发生溶胀，移植体内后过度吸水膨胀会导致凝胶变形、变脆甚至破裂；（2）水凝胶机械性普遍较差，尤其抗疲劳性能缺乏，而该性能在生物应用中十分重要。有机水凝胶，因为其本身良好的双亲性，近年来受到了研究人员们的关注[6]。有机水凝胶本身源于“二元协同互补”的概念，逐渐演变为具备特殊性能的“不会溶胀”的水凝胶[7]。归因于其组成成分的复杂性，除了双亲性这一基本性质以外，有机水凝胶往往还拥有耐冻、形状记忆和表面可重构等多种性能。 

因此，本研究中构建了PHA/PEGDA-GDY这种有机水凝胶：所选用的有机凝胶成分是PHA聚合物。PHA族聚合物具备良好的生物相容性，现已有文献报道将其用作微球材料、药物载体和各种生物支架用于药物缓释和组织工程中。PHA中带有双键的聚合物如P3HB11V和P3HB10U等，拥有良好的自由可调控的有机/水凝胶互相切换性能，十分适合用作有机水凝胶中的有机组成成分[8]。除此之外，凝胶的力学性能，尤其是抗疲劳性也是本研究中的另一重点。常见的提高水凝胶力学性能的方法包括构建双网络水凝胶、掺入纳米颗粒等[9]。GDY是一种由sp-和sp^2-杂化碳原子层组成的单原子碳同素异形体的新型二维材料，具有丰富的碳化学键、大的共轭体系、宽面间距和优良的化学稳定性，在各个领域得到了进一步的研究[10]。在生物医学研究中，GDY表现出优异的生物性能，被用作骨再生和辐射防护的支架组成材料，但是少见用于组织工程血管或用来加强水凝胶力学性能[11]。因此，本研究以常见的生物相容性水凝胶——PEGDA水凝胶为主体，采用点击化学的方式与PHA有机凝胶发生反应，制备出有机水凝胶；为了加强凝胶的力学性能，在其中混入分散均匀的GDY纳米颗粒，经光照交联后制备成抗疲劳双亲性的有机水凝胶（图1）。

图1 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶的制备模式图

（图源：Hou J, et al., Sci Adv, 2022）

首先，本研究对PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶的构建进行了摸索，最后得出的条件为PHA（45%双键含量的P3HB10U和2000分子量的HS-PEG-SH以1 : 0.25当量）和PEGDA以1 : 1比例混合、加入0.1%浓度的GDY纳米颗粒后，经紫外光照射发生点击化学反应后制备而成。溶胀实验结果提示：PHA/PEGDA-GDY凝胶具备良好的双亲性，通过溶胀实验的结果表明，PHA凝胶在有机相中会发生过度溶胀、在水相中则会坍塌；相反地，PEGDA凝胶在水相中会发生过度溶胀，在有机相中则会坍塌；PHA/PEGDA凝胶和PHA/PEGDA-GDY凝胶则在水相/有机相中均可以不会发生过度溶胀或坍塌，具备良好的双亲性（图2）。

图2 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶的溶胀实验

（图源：Hou J,et al., Sci Adv, 2022）

其次，对PHA/PEGDA-GDY凝胶进行了表面形貌的表征和力学性能的检测。实验结果提示，凝胶表面呈现出多孔状，孔径大小在25μm左右；同时，凝胶表面的原子力显微镜结果提示，混入石墨炔后的有机水凝胶表面粗糙度反而降低（考虑是因为纳米颗粒混入后提高了凝胶的表面稳定性）PHA/PEGDA-GDY凝胶相对于其他组，明显抗拉伸性能增强，同时具备优秀的抗疲劳性，可以承受2000次以上的循环拉伸。PHA/PEGDA-GDY凝胶的流体力学性能结果提示，凝胶的抗流体剪切力明显增强（图3）。

图3 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶的表面形貌和力学性能

（图源：Hou J, et al., Sci Adv, 2022）

另外，本研究所制备的抗疲劳双亲性有机水凝胶在体外生物相容性良好，人脐静脉血管内皮细胞和血管平滑肌细胞可以正常粘附并且增殖，并且表达各自特定的标志物蛋白；同时细胞在凝胶内可以正常延展，具备良好的形态（图4）；凝胶血管种植HUVECs和VSMCs后细胞扩增良好，并且具备正常的功能；PHA/PEGDA-GDY凝胶种植于SD大鼠背后，不同时间点取出进行取材拍照和HE染色，实验结果证明在体内生物相容性良好，凝胶内可见明显的细胞浸润和组织再生，并且具备良好的促进微血管再生的功能（图5）。

图4 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶在体外的生物相容性

（图源：Hou J, et al., Sci Adv, 2022）

图5 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶在体内的生物相容性

（图源：Hou J, et al., Sci Adv, 2022）

最后，也是最重要的，本研究将制备的抗疲劳双亲性有机水凝胶所用模具法构建为小直径血管移植物（外径3mm、内径2mm）移植于兔颈动脉缺损后可以保持远期（＞3个月）血管内通畅，无血栓形成，血流速度和血管内径均接近于正常组；PHA/PEGDA-GDY凝胶血管植入体内后，结构可保持完整，且移植3个月后管壁厚度与灌流面积均与正常组相似（图6），可见血管的细胞增殖和细胞外基质沉积（图7）；PHA/PEGDA-GDY凝胶血管植入体内后可以激活M2系统，抑制M1系统，减弱免疫排斥反应，促进组织再生。

图6 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶血管移植兔颈动脉缺损修复

（图源：Hou J, et al., Sci Adv, 2022）

图7 PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶血管取材后免疫荧光染色

（图源：Hou J, et al., Sci Adv, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究创新性地制备了PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶，具有两亲性、抗疲劳性和良好的体内外生物相容性。此外，PHA/PEGDA-GDY作为血管移植物时，细胞浸润性好，不良免疫反应少，细胞成分和细胞外基质成分再生良好。此外，本研究还阐明了以PHA和PEGDA为基础的有机水凝胶作为生物材料的可能性，以及GDY纳米颗粒在机械强化中的重要作用。最重要的是，PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶的优异性能也验证了其进一步应用于生物材料和再生医学的可能性。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，不可否认需要额外的努力来改进PHA/PEGDA-GDY凝胶的力学（包括最终拉伸和破裂应变），以达到临床血管移植标准。其次，有必要评估不同尺寸的凝胶SDVG，以拓宽其应用。最后但并非最不重要的是，将PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶植入大型啮齿类动物(如兔子)中还不足以证实其临床应用的可能性，因此必须进行PHA/PEGDA-GDY有机水凝胶作为血管移植在大型动物模型（如猪和食虫猴）中的临床前研究，在其进一步推广至临床使用的道路上仍然存在许多难题。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn5360

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本文完