Cell Chem Bio︱杨财广课题组发现线粒体ClpP激动剂抗胰腺癌

撰文︱王蓬宇 

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

代谢和生物能量途径改变是肿瘤的重要标志[1]。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其蛋白功能的维持，包括正确折叠、聚集，以及必要时被降解，需要蛋白水解酶和分子伴侣的参与。而异常或错误蛋白质的积累会引起蛋白质毒性应激，导致细胞死亡[2]。

ClpP是高度保守的丝氨酸蛋白水解酶，广泛存在原核生物和真核生物中。十四聚体的ClpP与六聚体的分子伴侣ClpX形成ClpXP复合物，负责水解错误折叠或异常的蛋白。杨财广组早期针对金黄色葡萄球菌（SaClpP）开展调控机制相关的结构和功能研究[3-5]。2021年，杨财广组发现ClpP激动剂ONC212可激动水稻白叶枯病菌ClpP（XooClpP），对水稻细菌性叶枯病感染具有较好的救治效果[6]。

人源ClpP（HsClpP，下统称ClpP）是线粒体基质中的蛋白水解酶，维持线粒体蛋白水解稳态和质量控制[7,8]。小分子化合物激动线粒体ClpP已被证明可以干预白血病的发生和发展[9]。然而，在实体瘤中ClpP功能知之甚少，可否在实体瘤中通过激动ClpP的蛋白水解功能抗肿瘤目前仍不清楚。开发设计新骨架结构、高靶向选择性的ClpP激动剂开展实体瘤相关的化学生物学研究仍十分重要。

2022年7月28日，中国科学院上海药物研究所化学生物学研究中心杨财广研究团队在Cell Chemical Biology期刊在线发表题为：“Aberrant human ClpP activation disturbs mitochondrial proteome homeostasis to suppress pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究论文。该研究报道了一类新骨架的ClpP小分子激动剂，并概念性验证异常激活ClpP扰乱线粒体蛋白质组稳态是胰腺癌治疗的有效策略，对深入认识靶向细胞线粒体蛋白质量控制抗肿瘤提供理论依据。

研究者首先从临床数据库挖掘入手，发现ClpP高表达的胰腺导管腺癌（PDAC）患者预后更好，表明ClpP在胰腺癌中是一个良性的预后指标（图1A）。为了探究ClpP在胰腺癌中的具体功能，研究者利用多西环素诱导表达系统，构建了稳转过表达野生型（WT）、功能激活突变（Y118A）和功能丧失突变（S153A）。通过MTT和克隆形成实验，研究者发现ClpP水解功能的提高会抑制胰腺癌细胞的增殖能力，而S153A ClpP过表达不影响细胞生长（图1C, 1D）。裸鼠移植瘤实验表明ClpP过表达可以抑制胰腺癌生长（图1E）。这些数据初步表明可以针对胰腺癌开发ClpP激动剂研究。

图1 ClpP过表达抑制PDAC的肿瘤发生

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

研究者由此入手开展高通量筛选ClpP小分子激动剂，利用体外纯化表达的ClpP蛋白，经过筛选约4000个候选小分子，发现了小分子ICG-001具有激动ClpP活性。通过进一步的化学结构改造和优化，研究者得到新骨架线粒体ClpP激动剂ZG111（图2A），其在体外生化酶活和结合能力均明显强于原型小分子ICG-001（图2B-D）。研究者进一步通过结构生物学手段，得到了ClpP/ZG111复合物晶体结构，解释了其激动ClpP的机制。14个ZG111分子结合到ClpP十四聚体的疏水口袋上，并通过蛋白质构象变化增大十四聚体轴向孔，增加其对底物蛋白的水解活性（图2E, F）。

图2 开发ClpP小分子激动剂ZG111

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

研究者进一步探究ZG111是否可以在胰腺癌细胞内影响线粒体相关功能的改变。首先通过MTT实验和克隆形成实验表明，ZG111具有较好的抑制PDAC细胞增殖的能力。由于ClpP水解的底物主要是线粒体呼吸链蛋白，研究者接着通过免疫印迹实验分析了ClpP激动后的蛋白改变。发现Y118A ClpP过表达和ZG111处理后，均可引起PDAC细胞系中线粒体呼吸链复合物的减少，并降低线粒体膜电位水平，表明胰腺癌细胞的线粒体的功能在ClpP激动后受到抑制。由于呼吸链蛋白与线粒体氧化磷酸化和活性氧生成密切相关，研究者进一步检测发现ZG111处理的胰腺癌细胞氧化磷酸化功能明显下降，并引起线粒体活性氧水平提高（图3）。上述结果表明ZG111通过引发线粒体功能失调抑制PDAC细胞生长。

图3 ZG111引发线粒体功能失调抑制胰腺癌细胞生长

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

为了进一步探究ZG111的胞内靶向性，研究者首先利用细胞热稳定迁移实验(CETSA)确证了小分子和目标蛋白的相互作用，ZG111处理2小时后，ClpP蛋白的热稳定性较对照组显著提升（图4A-B）。此外，研究者利用慢病毒系统构建了过表达和敲低CLPP的PDAC细胞系，发现ZG111对过表达CLPP的胰腺癌细胞杀伤效果明显增加；而对敲低CLPP的细胞的细胞活性明显下降（图4C, 4E）。这些结果表明ZG111能够胞内靶向线粒体ClpP。

图4 ZG111胞内靶向线粒体ClpP

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

进一步研究者探究ClpP激动对胰腺癌细胞基因转录的影响。首先研究者利用RNA转录组分析BxPC-3细胞在ClpP异常激活（Y118A ClpP过表达与ZG111处理）后的整体基因转录情况。通过基因富集分析发现，MAPK信号通路和内质网压力应激反应（ER stress response）在ClpP激动后明显激活（图5A, 5B）。相关的基因如MAPK信号通路（JUN, MAPK8, MAPK9）及内质网压力应激反应（ATF3, DDIT3, ERN1）转录水平增加（图5C, 5D），且蛋白水平也检测到激活。而JNK信号通路抑制剂SP600125加入后，ZG111处理引起ATF3和CHOP的增加被抑制，这表明内质网压力应激反应的激活依赖c-Jun/JNK信号通路的活化（图5E）。而MTT实验也表明ZG111的抗肿瘤作用在SP600125处理后被明显抑制（图5F）。此外,Y118A ClpP过表达的胰腺癌细胞也有相关信号通路的激活（图5G）。这些结果表明ClpP激动激发c-Jun/JNK信号通路与内质网压力应激反应的激活。

图5 ClpP激动引发的下游信号通路

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

最后，研究者在动物水平上评价了ZG111对胰腺癌的治疗作用。BALB/c裸鼠每日腹腔注射40 mg/kg的ZG111，对于胰腺癌BxPC-3细胞系来源的裸鼠移植瘤具有较明显的抑制作用（图6A）。此外，研究者利用胰腺癌病人肿瘤样本构建了病人来源的异种移植小鼠肿瘤模型，ZG111均具有较好的抗肿瘤作用（图6B）。并且可以在动物肿瘤组织中观察到JNK/c-Jun通路和内质网压力应激反应的激活（图6C, 6D）。这些结果表明ZG111具有一定的临床应用价值，或可用于胰腺癌的治疗。

图6 ZG111的体内抗肿瘤活性

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

图7 化学激动线粒体ClpP抑制胰腺癌生长示意图

（图源：Wang P et al., Cell Chem Biol, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究主要探究了丝氨酸蛋白水解酶ClpP激动是否是治疗胰腺癌的一种可行方法。发现胰腺癌细胞中提高ClpP的水解功能能够有效抑制胰腺癌细胞的增殖，由此开发评价了新骨架的线粒体ClpP激动剂ZG111。生物学评价表明ZG111能够高度靶向ClpP并具有较好的酶活、细胞和动物活性。同时，ZG111可抑制胰腺癌细胞来源的裸鼠移植瘤以及病人样本来源的PDX肿瘤模型，这表明ClpP激动在胰腺癌治疗中的可行性。该研究表明，小分子通过异常激活ClpP扰乱线粒体蛋白质组内稳态是胰腺癌治疗的一种有效策略。ZG111在多种肿瘤模型的治疗结果为ClpP激动剂用于化学生物学研究提供了积极参考（图7）。其次，除胰腺癌外，ClpP激动剂或可在其他不同类型的癌症治疗中实现更为广泛的应用。最后，ZG111的发现从结构上丰富了ClpP激动剂的结构多样性，也为ADEP衍生物和ONC201在内的小分子激动剂的抗肿瘤机制提供新的见解。不足之处在于该研究并未阐明ClpP激活引起的线粒体来源的压力应激是如何传递到内质网和细胞核的，以及细胞是如何感知线粒体产生的信号。这些问题仍有待进一步研究。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S2451945622002458

上海药物研究所博士研究生王蓬宇、助理研究员张涛博士、上海交通大学医学院附属瑞金医院主治医师王新景博士为论文的共同第一作者。上海药物研究所杨财广研究员为该论文的通讯作者。该研究得到复旦大学周璐课题组和甘建华课题组，贵州大学杨松课题组，上海交通大学医学院附属瑞金医院陆熊熊课题组，清华大学张永辉课题组和上海同步辐射光源的支持，并获得了国家自然科学基金的资助。

通讯作者：杨财广 

（照片提供自上海药物研究所化学生物学中心杨财广实验室）

通讯作者简介：（上下滑动阅读）  

杨财广，中国科学院上海药物研究所研究员，国科大杭州高等研究院药物科学与技术学院教授，国家杰出青年科学基金者获得者。1997年毕业于华中理工大学（现华中科技大学），获学士学位；2002年在中科院上海有机化学研究所获得博士学位；同年到芝加哥大学从事博士后研究；2008年就职上海药物研究所，任课题组长；2020年兼任国科大杭州高等研究院教授。在Nature、Cancer Cell、Cell Metabolism、PNAS、JACS等杂志发表SCI论文70余篇，申请专利10余件。荣获中国化学会化学生物学（突出贡献）奖、药明康德生命化学研究（学者）奖，入选国家“万人计划”、科技部“中青年科技创新领军人才”、上海市“优秀学术带头人”、中科院“百人计划”。目前任RSC Chemical Biology 副主编、Chinese Journal of Chemistry编委。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完