Nat Metab︱周雍进团队揭示甲醇代谢压力机制，实现脂肪酸高效合成
作者︱高教琪，周雍进
责编︱王思珍
编辑︱杨 婵
随着石油等资源的日益枯竭，越来越需要新的原料来满足人们不断增长的生物炼制需求。甲醇是理想可再生原料，其能量密度较高、来源广泛，且能够与现有设备对接[1]。目前甲醇可以由甲烷大量制备，特别是，近年来实现电催化和光催化以CO2为原料制备甲醇，有望实现可持续、可再生甲醇生产模式，助力我国“双碳”战略[2]。因此，构建微生物细胞工厂实现甲醇生物转化为高附加值化学品具有应用潜力[3]。脂肪酸衍生物是油脂化工品、食品、生物燃料和材料等生产的基础原料，广泛应用于日常生产、生活各个方面。传统动、植物油脂产量有限[4]，难以满足日益增长的需求，亟待发展油脂生产新技术。甲醇生物转化有望建立不依赖于耕地的脂肪酸供给路线[5-6]。然而，微生物胞内甲醇代谢调控严谨复杂，且甲醇利用产生毒性代谢压力，限制了甲醇生物转化效率。
2022年7月11日，中国科学院大连化学物理研究所周雍进研究员团队在Nature Metabolism上发表了题为“Rescuing yeast from cell death enables overproduction of fatty acids from sole methanol”的研究。在甲醇酵母中，通过适应性进化与理性代谢工程改造相结合的方式，并借助多组学测序分析，缓解甲醇代谢压力，实现了甲醇生物转化高效合成脂肪酸。
首先，研究团队构建了产脂肪酸的多形汉逊酵母工程菌株，通过敲除脂酰辅酶A合酶（由基因FAA1编码），从而阻断了β-氧化过程，导致脂肪酸积累（图1b）。构建的工程菌株在葡萄糖基础培养基中生长正常，且能高效合成脂肪酸，而野生型汉逊酵母不能积累脂肪酸（图1c）。但是，该菌株在甲醇中无法生长，而野生型汉逊酵母在甲醇中生长正常（图1d）。初步推测，可能是由于脂肪酸合成与细胞生长强烈竞争甲醇代谢流，导致细胞死亡。但是，研究人员通过理性改造强化甲醇代谢前体5-磷酸木酮糖以及辅因子NADPH供给，均无法恢复产脂肪酸工程菌株在甲醇中的生长。因此，研究团队采用了实验室适应性进化技术，将产脂肪酸工程菌株在含有葡萄糖和甲醇（初始比例为5：5）的基础培养基中进行连续传代培养，并逐步增加甲醇占比，直至菌株能够在以甲醇为唯一碳源的基础培养基中进行生长，获得的驯化菌株能够在甲醇基础培养基中正常生长且高效合成脂肪酸（图1d）。
图1 实验室适应性进化恢复产脂肪酸汉逊酵母在甲醇中生长
（图源：Gao JQ, et al., Nat Metab, 2022）
为了解析其中机制，将获得的驯化菌株进行了全基因组测序分析，鉴定了两个关键突变基因LPL1（推测脂酶）和IZH3（与Zn代谢相关膜蛋白）（图2a）。在产脂肪酸工程菌株中双敲除LPL1和IZH3基因能够部分恢复菌株在甲醇中的生长（图2b）。通过检测甲醇代谢关键有毒中间产物甲醛的含量，发现产脂肪酸菌株大量积累甲醛，而野生型菌株和驯化菌株甲醛含量始终处于较低水平，双敲除LPL1和IZH3基因的菌株也能够显著降低甲醛积累，保证细胞在甲醇中存活（图2c）。令人惊喜的是，研究人员发现在野生型汉逊酵母中双敲除LPL1和IZH3基因还能够提高菌株甲醇耐受能力，其在50 g/L高甲醇浓度条件下，生长明显加快（图2d）。进一步，将野生型、产脂肪酸以及驯化菌株分别进行了脂质组学分析，发现产脂肪酸菌株磷脂合成缺陷，关键磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺含量显著降低，从而影响了膜，特别是过氧化物酶体膜完整性，导致关键有毒中间体甲醛泄漏，引起细胞坏死。而敲除LPL1和IZH3能够缓解磷脂分解，保持细胞膜完整性，从而缓解甲醇代谢压力（图2e）。
图2 生物合成过程中甲醇毒性机制解析
（图源：Gao JQ, et al., Nat Metab, 2022）
最后，在转录组学数据指导下进行了全局代谢重排。首先，过表达汉逊酵母内源果糖1,6-二磷酸酶（由基因FBP1编码）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（由基因ZWF1编码），增加糖异生与磷酸戊糖途径代谢流，偶联5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶（由基因RPE编码），从而增加甲醇代谢前体5-磷酸木酮糖供给；其次，引入来源于大鼠的ATP-柠檬酸裂解酶（由基因MmACL编码）增加脂肪酸合成前体乙酰辅酶A供给；最后，表达来源于酿酒酵母的异柠檬酸脱氢酶（由基因ScIDP2编码），强化辅因子NADPH供给（图3a）。以最终构建的工程菌株进行发酵罐批式补料发酵，在以甲醇为唯一碳源的条件下，发酵192 h，合成了15.9 g/L脂肪酸（图3b）。
图3 全局代谢重排促进脂肪酸合成
（图源：Gao JQ, et al., Nat Metab, 2022）
图4 实验室适应性进化使产脂肪酸菌株在甲醇中恢复生长，犹如“凤凰涅槃”
（图源：中国科学院大连化学物理研究所周雍进研究员团队）
该工作第一作者是中国科学院大连化学物理研究所副研究员高教琪，通讯作者为周雍进研究员。上述工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金面上项目、大连化物所科研创新基金等项目的资助。
第一作者高教琪（左），通讯作者周雍进（右）
（照片提供自：周雍进实验室）
通讯作者简介：（上下滑动阅读）
第一作者，高教琪，博士，中国科学院大连化学物理研究所副研究员。主要从事酵母细胞代谢工程改造以及甲醇等原料生物转化过程研究。承担国家重点研发计划、国家自然科学基金青年项目、中国科学院大连化学物理研究所创新基金等项目。曾在Nature Metabolism、Nature Chemical Biology、iScience等著名学术期刊发表论文20余篇，申请发明专利10余项。
通讯作者，周雍进，博士，中国科学院大连化学物理研究所长聘研究员，博士生导师，张大煜优秀学者。主要研究领域为合成生物学、代谢工程及酵母遗传工程。曾在Cell、Nature Energy、Nature Metabolism、Nature Chemical Biology及PNAS等著名学术期刊发表论文70余篇，被引用3500余次。获得中科院人才计划，国家引进人才计划及国家自然科学基金委优秀青年基金支持。
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【7】Sci Adv | 金勇丰团队发文报道RNA反式剪接机制研究上取得进展
【8】Cell Prolifer︱孙少琛团队揭示霉菌毒素NIV对卵母细胞成熟毒性的新途径
参考文献（上下滑动阅读）
[1] Olah, G.A. Towards oil independence through renewable methanol chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 104-107 (2013).
[2] Li, H. et al. Na+-gated water-conducting nanochannels for boosting CO2 conversion to liquid fuels. Science 367, 667-671 (2020).
[3] Cotton, C.A., Claassens, N.J., Benito-Vaquerizo, S. & Bar-Even, A. Renewable methanol and formate as microbial feedstocks. Curr. Opin. Biotechnol. 62, 168-180 (2020).
[4] Chen, Y.H., Jung, H.W., Tsuei, C.Y. & Liao, J.C. Converting Escherichia coli to a synthetic methylotroph growing solely on methanol. Cell 182, 933-946 (2020).
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[7] Liu, Y. et al. Biofuels for a sustainable future. Cell 184, 1636-1647 (2021).
本文完