Sci Adv | 金勇丰团队发文报道RNA反式剪接机制研究上取得进展

撰文︱侯守庆

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

黑腹果蝇唐氏综合征细胞粘附分子1（Dscam1）基因通过互斥可变剪接编码38016种潜在亚型，在神经和免疫系统中起到重要作用。2016年，金勇丰教授团队研究发现，螯肢动物中存在一种“截短”的Dscam基因（命名为sDscam）[1]。此类sDscam基因与果蝇Dscam1序列具有高度相似性，但其5'端又与脊椎动物成簇的原钙粘蛋白（cPcdh）基因具有明显的结构相似性，是果蝇Dscam1和脊椎动物cPcdh的“杂合”形式。与脊椎动物cPcdh基因类似，该sDscam基因通过选择性启动子及可变剪接相结合方式产生异构体多样性。这些sDscam亚型介导细胞黏附，具有严格的嗜同型特异性[2]。然而，与果蝇Dscam1和脊椎动物cPcdh相比，目前对螯肢动物亚门sDscam亚型多样性的分子调控机制尚不清楚。

2022年7月6日，浙江大学生命科学学院金勇丰教授团队在Science Advances上发表了题为“Trans-splicing facilitated by RNA pairing greatly expands sDscam isoform diversity but not homophilic binding specificity”的研究。该研究阐明竞争性RNA二级结构介导sDscam反式剪接增加亚型多样性的调控机制。

在该研究中，金勇丰团队揭示了二斑叶螨中存在一个复杂的sDscamβ基因座，其由4个串联排列的sDscamβ基因组成（图1A）。研究者通过RNA-seq数据分析发现，sDscamβ每个可变外显子盒可以与来自另一个基因的组成型外显子发生反式剪接，从而增加亚型数目（图1B）。研究者进一步通过RT-PCR系统验证了5′可变外显子盒和3′组成型外显子的潜在组合（图1C-I）。

图1 二斑叶螨中通过多启动子和顺式与反式可变剪接产生多样亚型的sDscam位点

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

通过序列比较分析，研究人员发现sDscamβ组成型外显子上游的内含子中存在锚定位点（图2A）。随后，在紧邻可变外显子盒的下游内含子中确定了对应的反向互补序列，即选择序列（图2A）。二斑叶螨sDscamβ锚定位点和选择序列间的碱基配对作用将可变外显子盒与组成型外显子间的距离大大缩短。

进一步地，研究人员通过突变和回复补偿突变实验证实，同一基因内的竞争性RNA配对能够调控可变外显子盒的选择（图2B-G）。当RNA二级结构被破坏时，邻近5′可变盒被剪接到成熟mRNA中的量明显降低，而当RNA二级结构被恢复时，其邻近5′可变盒被剪接到成熟mRNA中的量则恢复到野生型水平。因此，内含子竞争性RNA配对在调控sDscamβ基因5′可变区的顺式剪接方面起着重要作用。

图2 内含子竞争性 RNA 配对介导sDscamβs的5' 可变盒选择

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

大量的二斑叶螨sDscamβ异构体通过可变外显子盒和组成型外显子之间的反式剪接产生（图1B）。研究表明，RNA二级结构可以促进反式剪接[3 , 4]，sDscamβ锚定位点可以与来自另一个基因簇的几乎任何选择序列配对。破坏基因间RNA二级结构可以显著降低反式剪接产物，而基因间RNA二级结构的恢复使反式剪接产物变为野生型水平（图3）。因此，基于以上系列实验数据，建立了内含子竞争性RNA二级结构调控可变顺式和反式剪接的模型。

图3 内含子 RNA 配对促进sDscamβ可变区与不同组成区的反式剪接

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

研究人员进一步分析了sDscamβ亚型的细胞黏附功能。细胞聚集实验表明，sDscamβ顺式和反式剪接亚型均可以介导细胞聚集，但细胞聚集的大小在各个顺式和反式剪接异构体之间有着很大差异（图4）。另外，具有相同可变区但恒定区不同的异构体之间在聚集能力上具有明显差异，这表明通过反式剪接产生的不同恒定结构域可能会影响嗜同型反式结合的活性（图4）。

图4 二斑叶螨sDscamβ反式和顺式剪接亚型的嗜同型结合分析

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

细胞聚集特异性实验表明，sDscamβ亚型具有严格的嗜同型结合特异性（图5）。即使是Ig1-2可变结构域序列相似性为97.6%的β1V9C1/β2V10C2组合，也形成了分离的聚集体（图5A）。对比之下，具有相同可变结构域的sDscamβ组合形成了不同细胞的混合聚集（图5B）。

图5 二斑叶螨sDscamβ亚型表现出N端可变结构域的特异结合

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

并且，研究人员通过Ig结构域互换实验证实嗜同型结合特异性取决于可变Ig1结构域（图6A）。研究者利用同源建模获得二斑叶螨sDscamβ的嗜同型结合复合物，模型显示Ig1结构域以反平行方式结合（图6B）。因此，二斑叶螨sDscamβ的第一个Ig结构域决定了相邻细胞表面的蛋白质反式嗜同型结合特异性。

图6 嗜同型结合特异性取决于可变Ig1结构域

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

研究人员发现，具有不同N端可变结构域的多个sDscamβ共表达能够产生新的组合识别特异性（图7）。该研究表明，RNA配对调控的反式剪接极大地扩展了sDscam亚型的多样性，但未增加嗜同型结合特异性。

图7 不同sDscamβ顺式和反式剪接亚型共表达产生的组合识别特异性

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

图8 竞争性RNA配对调控sDscamβ反式剪接扩展分子多样性的机制模型

（图源：Shouqing Hou, et al., Sci Adv, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，基于以上系列实验数据，研究者建立了竞争性RNA二级结构调控可变顺式和反式剪接的模型（图8）。这些发现极大地拓展了人们对RNA和蛋白质亚型多样性调控机制的理解，并对阐明神经元特异性的分子基础具有重要意义。此外，可变盒的多外显子结构是否有助于二斑叶螨sDscamβ通过可变顺式或反式剪接来增加异构体多样性，还需要进一步研究。竞争性RNA配对调控二斑叶螨sDscam基因转录的机制，是否在其他物种和基因中保守，需后续进一步研究。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn9458

浙江大学生命科学学院金勇丰教授为论文的通讯作者，金勇丰团队博士生侯守庆、李果为论文的共同第一作者，杭州师范大学生命与环境科学学院孟一君研究员、金勇丰团队研究生徐兵兵等参与了该项工作。该工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、浙江省自然科学基金和浙江大学上海高等研究院繁星科学基金等项目的资助。

共同第一作者侯守庆（左）与李果（右）

（照片提供自：浙江大学生命科学学院金勇丰实验室）

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参考文献：

[1] Y. Yue, Y. Meng, H. Ma, S. Hou, G. Cao, W. Hong, Y. Shi, P. Guo, B. Liu, F. Shi, Y. Yang, Y. Jin, A large family of Dscam genes with tandemly arrayed 5′ cassettes in Chelicerata.Nat. Commun. 7, 11252 (2016）

[2] F. Zhou, G. Cao, S. Dai, G. Li, H. Li, Z. Ding, S. Hou, B. Xu, W. You, G. Wiseglass, F. Shi, X. Yang, R. Rubinstein, Y. Jin, Chelicerata sDscam isoforms combine homophilic specificities to define unique cell recognition.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 117, 24813–24824 (2020).

[3] S. E. Fischer, M. D. Butler, Q. Pan, G. Ruvkun, Trans-splicing in C. elegans generates the negative RNAi regulator ERI-6/7. Nature 455, 491–496 (2008).

[4] R. Kamikawa, Y. Inagaki, M. Tokoro, A. J. Roger, T. Hashimoto, Split introns in the genome of Giardia intestinalis are excised by spliceosome-mediated trans-splicing. Curr. Biol. 21, 311–315 (2011).

本文完