STTT︱梁德生团队研发血友病A原位基因编辑治疗新策略

撰文︱胡志青

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

血友病A（hemophilia A，HA）是最常见的遗传性凝血功能障碍疾病，在男性中发病率约为1/5000，其中重型患者约占HA患者的50%，常因关节反复出血而致残，甚至可能发生颅内出血而危及生命。至今尚无根治方法，重型患者需终生反复使用蛋白替代治疗。基因治疗有望治愈血友病。HA由F8基因突变导致功能性的凝血因子VIII（FVIII）缺乏而引起。常见的基因治疗策略包括基因添加与基因修复。基因添加通常是利用病毒载体将外源启动子引导的治疗基因导入缺陷细胞中，实现目的蛋白的表达，但该策略常受限于病毒载体的装载能力，而F8基因cDNA长达9 kb，这对目前的病毒载体系统是一个比较大的挑战。约有30%-60%人群存在针对不同血清型腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）衣壳的抗体[1]，且不同血清型存在交叉免疫，这就极大地限制了其广泛应用。值得注意的是，病毒元件的使用存在插入突变的风险[2]。另一种基因治疗策略是原位修复，即在缺陷基因的原位点进行精确的基因修复或消除突变的致病性效应。这不仅恢复了基因的功能，同时还保留了基因的原位调控元件，修复后的基因能够达到正常的生理状态，因此被认为是最理想的基因治疗方式。开发新型原位基因编辑策略有望实现HA基因治疗。

2022年6月20日，中南大学梁德生教授/周妙金博士课题组在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了题为“Targeted B-domain deletion restores F8 function in human endothelial cells and mice”的研究。该研究基于功能性FVIII结构分析，创新性开发出一种通用型的HA基因编辑治疗新策略。

FVIII包括3个A区，1个B区和2个C区结构域，在记录的3246种F8基因突变中，有475种发生在B区编码序列中（F8-B），其中90%以上的突变致使翻译提前终止，导致重型HA；据报道有15-26%的重型HA患者致病突变发生该区域，B区占FVIII总长的39%，但最终发挥凝血活性的FVIIIa中不包含B区，且重组B区缺失型的FVIII（B domain deletion FVIII，BDD-FVIII）在临床治疗中具有凝血功效，另外，通过外源基因添加B区缺失型的F8（B domain deletion F8，BDD-F8）也显示出一定的治疗效果。前期作者利用CRISPR/Cas9与单链寡聚脱氧核糖核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotides，ssODN）在F8-B移码突变的重型HA病人诱导多能干细胞（HA-iPSCs）中实现原位微小框内缺失，使移码突变的F8阅读框在原位由移码突变转变为框内缺失突变，从而表达功能性FVIII[3]。据此，在本研究中，作者推测内源F8基因B区编码序列完全靶向缺失不会影响内源性FVIII的凝血功能，并进一步提出一种可覆盖F8-B内全部致病突变的“通用型”原位基因编辑治疗策略：靶向缺失F8-B从而恢复功能性FVIII表达。为了证明这一推测，作者在F8-B移码突变的重型HA-iPSCs中，利用CRISPR/Cas9与ssODN在F8基因原位高效靶向缺失F8-B。并将基因编辑后HA-iPSCs定向分化为内皮祖细胞（iEPCs）和内皮细胞（iECs），实验证实基因编辑后的iECs中FVIII的表达、分泌与活性均得到恢复（图1）。

图1 基因修复后iECs内FVIII表达得到修正

（图源：Hu ZQ, et al., STTT, 2022）

作者将原位基因编辑后的iPSC定向分化为iEPCs，并移植iEPCs至HA模型小鼠体内评估疗效，移植两周后小鼠血浆FVIII凝血活性显著提高，断尾实验也显示移植基因编辑iEPCs组小鼠存活时间与存活率显著长于移植未进行基因修复iEPCs组，表明移植基因编辑iEPCs可以显著改善模型小鼠的出血表型。进一步证实F8-B的靶向缺失不会影响内源性FVIII的凝血功能。

图2 基因修复后iEPCs移植至HA小鼠体内疗效评估

（图源：Hu ZQ, et al., STTT, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上，该研究首次在F8原位实现B区编码序列的靶向缺失，并应用于血友病基因治疗研究，为所有B区编码序列突变的HA患者提供一种通用且高效的基因治疗方法。同时，该研究在国际上首次证明F8-B靶向缺失的内源性FVIII具有凝血功能，为重组B区缺失型FVIII的临床应用和B区缺失F8转基因治疗研究提供理论依据。该原位治疗策略的成功实施有助于我国自主知识产权的HA基因治疗技术与药物的开发，同时也促进了基因编辑干细胞治疗的临床转化。该治疗策略在体内的长效性还有待进一步研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-022-01016-9

中南大学博士后胡志青为论文第一作者，梁德生教授和周妙金博士为共同通讯作者，中南大学生命科学学院为唯一完成单位。该研究得到了国家重点研发项目、国家自然科学基金项目、中国博士后科学基金第2批特别资助、湖南省自然科学基金项目的支持。

第一作者胡志青（左），通讯作者梁德生（右）

（照片提供自：中南大学梁德生实验室）

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参考文献

[1] Verdera HC, et al., AAV Vector Immunogenicity in Humans: A Long Journey to Successful Gene Transfer. Mol Ther. 2020;28(3):723-746.

[2] Nguyen GN, et al., A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nat Biotechnol. 2021;39(1):47-55.

[3] Zhiqing H, et al., ssODN-Mediated In-Frame Deletion with CRISPR/Cas9 Restores FVIII Function in Hemophilia A-Patient-Derived iPSCs and ECs. Mol Ther Nucleic Acids. 2019;17:198-209.

本文完