Biophysical J︱安海龙团队揭示棕榈酰化和膜环境影响下CD44同源二聚的分子机制

撰文︱马子祎，孙夫德

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

分化簇44蛋白（Cluster-of-Differentiation-44，CD44）是一种单跨膜细胞表面粘附蛋白及抗癌药物靶标，在细胞迁移和癌症侵袭等各种细胞生理病理过程中发挥着重要作用[1,2]。CD44同源二聚化依赖近跨膜区半胱氨酸相互作用，进而介导胞内向胞外的信号转导过程。值得注意的是，相关半胱氨酸残基潜在发生棕榈酰化修饰（Palmitoylation），且越来越多的证据显示出棕榈酰化在CD44膜转移和蛋白识别中的引导作用[3,4]。已知棕榈酰化修饰可增强CD44与膜微区域——脂筏（lipid raft）的亲和力，致使CD44与骨架连接蛋白受体结合潜能下降，从而削弱细胞增殖及癌化进程[5,6]；课题组近期发现特异性膜分子磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）可与棕榈酰化竞争地调控CD44与脂筏亲和力，从而改变棕榈化CD44的膜域分布[5]。但迄今为止，尚不清楚CD44同源二聚化、棕榈酰化修饰和膜域偏好性之间的相关性以及调控细节。因此深入阐明棕榈酰化修饰和特定的膜微环境共调控的CD44二聚化分子机制，对于精准调控细胞癌化具有重要意义。

近日，河北工业大学生物物理研究所安海龙教授团队在国际高水平期刊Biophysical Journal上发表了题为“Molecular Mechanism of CD44 Homodimerization Modulated by Palmitoylation and Membrane Environments”的研究。硕士研究生马子祎是该文章的第一作者，孙夫德博士和安海龙教授是共同通讯作者。该研究基于Martini粗粒化模型构建了多种蛋白体系，利用单相态和二相态的细胞膜模拟体系，探究棕榈酰化修饰后CD44在不同膜环境下的二聚作用和结构，阐明了棕榈酰化、PIP2和脂筏在介导蛋白质同源二聚化中微妙的竞争关系。

作者选取CD44跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）及截断的胞质结构域（cytoplasmic domain，CTD）作为本课题的研究序列。该序列包含了CD44与胞质骨架连接蛋白（ERM）结合区域[7]以及两个与CD44聚合相关的半胱氨酸残基（Cys-286和Cys-295）。在DPPC单相态膜环境中，CD44野生型（CD44-WT）可以快速形成二聚体。Martini2.2及3.0力场条件一致性显示其二聚体结构主要依赖位于跨膜区的S275xxS278xxxI282xxxC286相互作用，而位于胞质域的C295相互作用较弱，这可能与胞质域更加无序的结构特性有关。进一步设置C286AC295A突变体，发现无论蛋白聚合效率还是结合自由能都有所降低，显示相关半胱氨酸在CD44二聚中的介导作用。

为探讨棕榈酰化修饰对CD44二聚化的影响，分别在286位点和295位点的半胱氨酸进行棕榈酰化修饰（Pal-286、Pal-295及Pal-dual）。结果显示棕榈酰化修饰显著增加了CD44二聚所需的时间，且棕榈化影响下的蛋白结合自由能有所降低（图1）。而且，C286的棕榈化修饰对CD44聚合能力及构象的影响比C295更为显著，与上文结果一致。基于模拟结果，CD44主要依赖跨膜区Cys-286形成同型二聚体，棕榈酰化不利于CD44二聚化并干扰二聚体构象。

图1. DPPC单相态膜中Pal-286、Pal-295和Pal-dual的二聚化和构象

（图源：Ziyi Ma, et al., Biophysical Journal, 2022）

研究发现多价阴离子PIP2可介导CD44等膜蛋白的自组装和定位偏好[5]。作者为探讨PIP2脂质分子对CD44二聚化的调节作用，将5％的PIP2（-4e）掺入到DPPC双层膜体系的下小叶。聚合效率和结合自由能分析表明，PIP2在CD44不同体系的二聚过程中均起到促进作用，但PIP2脂质分子会引起二聚体构象不同程度的混乱（图2）。PIP2脂质分子的调节具有特异性，PIP2一致性地与胞内富含碱性氨基酸的R292-294和K299-301相互作用。由于295位棕榈酰链位于R292-294和K299-301两个PIP2结合基序之间，所以棕榈酰基团会对PIP2介导的蛋白质二聚化产生直接干扰，这解释了Pal-295二聚体构象与Pal-286相比更加混乱，并出现多重构象（图2）。同时意味着胞质域上295位点棕榈酰化修饰后可干扰PIP2和蛋白质的黏附作用，导致Pal-295出现结合构象转变。可知，PIP2通过其头部与CD44胞质近膜域作用促进蛋白聚合，而位于其作用区的棕榈化基团会增加蛋白作用模式的不确定性。

图2.含有PIP2的单相态膜体系中CD44-WT、Pal-286、Pal-295和Pal-dual的二聚能力表征

（图源：Ziyi Ma, et al., Biophysical Journal, 2022）

有报道证明，使细胞膜呈现二相横向异质化的脂筏微环境在调节CD44聚合及其蛋白识别中有关键作用，并承载蛋白质棕榈酰化和细胞迁移的关联性[5]。课题组已证实Pal-295与Pal-286具备与脂筏更强的亲和性[5]。为进一步探究棕榈酰化修饰下脂筏对CD44二聚的影响，本研究分别将两个CD44-WT和Pal-295蛋白放置在可二相态分离（液态有序相Lo及液态无序相Ld）的膜体系中。模拟结果显示，相比于单相态膜体系，CD44-WT二聚化进程减缓并且无序结构增加，而Pal-295在20微妙模拟时长内始终没有完成二聚化，显示出脂筏（Lo）环境可显著抑制棕榈化修饰的CD44聚合过程（图3）。这主要是通过棕榈酰化侧链在脂筏区域位置锚定，不利于蛋白自由移动而实现的。

图3. 脂筏调控下CD44-WT和Pal-295二聚化和定位的比较

（图源：Ziyi Ma, et al., Biophysical Journal, 2022）

研究进一步将摩尔百分比为2％的PIP2分子掺入此膜体系。PIP2通过与CD44紧密结合及簇集作用，促进了CD44同源聚合。由于PIP2偏向非脂筏区的分布偏好性，PIP2-Pal295复合物会进入流动性更强的非脂筏区，从而恢复Pal295的聚合行为（图4）。值得注意的是，此时Pal295聚合交叉角度分布不再集中，聚合结构更加紊乱，而且PIP2影响下的蛋白胞质域变得更加延展。一方面，这种现象对于CD44跨膜信号传递是似乎必要的，有报道说明旋转胞质域二聚构象与CD44的“由内而外”信号转导是相呼应的[8]。另一方面，CD44受棕榈酰化修饰和膜环境影响的可变二聚体构象与胞质域释放和激活下游基因表达有关，并进一步调节肿瘤细胞生长和增殖[9]。综上所述，PIP2 分子会促进不同棕榈化修饰水平的CD44发生二聚化，并可使锚定于脂筏区的Pal-295释放空间自由度而实现二聚化，这不仅为CD44识别细胞骨架连接蛋白ERM提供条件，同时更为延展的CD44胞质域更有利于CD44-ERM相互作用，促进细胞粘附和迁移。

图4. 含有 PIP2 的相分离双层膜中 CD44-WT 和 Pal-295 二聚化和定位的比较

（图源：Ziyi Ma, et al., Biophysical Journal, 2022）

图5. 不同膜环境下棕榈酰化和膜微环境调节CD44二聚化转变及机制示意图

（图源：Ziyi Ma, et al., Biophysical Journal, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

脂酰化修饰和特异膜微环境对于蛋白质定向转移和结合十分重要，控制许多生物过程如蛋白质聚集和细胞迁移[10,11]。CD44胞外结构域的切割促进了肿瘤细胞的转移和侵袭，这是通过CD44胞质域棕榈化修饰和ERM连接其二聚体来调节的。在乳腺癌肿瘤细胞中，棕榈酰化修饰的CD44被认为可防止细胞迁移，因此阻断跨膜蛋白上的棕榈酰化可作为抑制肿瘤的潜在方法[5.12,13]。基于本研究结果，CD44同源二聚化依赖于近膜结构域上的半胱氨酸相互作用，这有利于透明质酸（hyaluronic acid, HA）与胞外结构域的结合。棕榈酰链的插入不利于CD44形成稳定二聚体，并会阻止CD44与ERM结合；其次，添加PIP2可以促进CD44棕榈酰化变体的二聚化，同时PIP2可以促进ERM与膜表面贴附，并积极与CD44在近膜胞质域发生稳定结合[14]。另外，脂筏环境不利于棕榈化的CD44空间移动及聚合，而PIP2使其迁回到非脂筏区域，从而恢复二聚化和蛋白受体识别能力（图5）。

由于膜微环境的差异和蛋白质在不同位置的修饰，CD44的二聚化和膜定位将通过不同的途径进行介导。此外，位置偏好性和二聚体构象（如聚合交叉角度和胞质区延展性）对特定膜分子和棕榈酰化敏感，由此产生的二聚体会对后续的信号转导产生影响。综上所述，本研究可加深我们对棕榈酰化修饰和膜微环境的跨膜蛋白自组装的理解，并为接下来相应的靶向药物研究提供了理论依据。

原文链接：https://www.cell.com/biophysj/fulltext/S0006-3495(22)00507-0

本文第一作者是河北工业大学理学院硕士研究生马子祎，通讯作者是河北工业大学生命科学与健康工程学院的孙夫德博士和安海龙教授。

本论文得到了河北省自然科学基金(C2019202244）及河北省教育厅重点项目(ZD2020140)的资助。

第一作者马子祎（右），通讯作者孙夫德（左）

（照片提供自：河北工业大学生物物理研究所）

通讯作者简介：

孙夫德，博士，河北工业大学元光学者，硕士生导师。2018年入职河北工业大学生物物理研究所，主要从事膜蛋白翻译后修饰活性调控机制、膜微环境调节蛋白结构与功能以及生物活性小分子自组装相关的分子动力学模拟研究工作。担任国际知名期刊《Soft Matter》以及《Progress in Biochemistry and Biophysics》审稿人。目前主持河北省自然科学基金青年项目及河北省教育厅重点项目各1项，参与国家自然科学基金3项。目前以第一作者或通讯作者在PLoS Comput. Biol.，Biophys. J.，J. Chem. Inf. Model.，J. Phys. Chem. B等国际知名学术期刊上发表10余篇研究成果。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完