STAR Protocols︱黄灿华团队发表基于细胞热迁移分析检测药物-蛋白结合位点的实验方案

撰文︱彭李缘

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

临床上大多数药物通过直接与特定靶蛋白的功能位点结合来达到治疗效果，药物和靶标的结合程度决定了药物的疗效和不良反应[1]。因此，评估药物和目标蛋白的结合情况有利于加深对药物作用机理的理解、便于监测药物疗效，从而加快新药开发进程。早期检测药物-靶点结合多利用体外纯化的蛋白，难以反映体内环境中药物和靶蛋白相互作用的真实情况。科学家们基于配体结合诱导靶蛋白热稳定的生物物理原理，开发了可在细胞或组织样本中原位监测药物与靶蛋白结合的细胞热迁移分析试验（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）[1-3]。如果特定药物与目标蛋白发生相互作用，则经过药物处理的蛋白在加热后比对照组更稳定。然而，原位分析药物-靶蛋白结合相关的氨基酸位点的实验方案仍有待进一步研究和验证。

2022年6月17日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室黄灿华教授团队在Cell旗下的Star Protocols杂志发表了题为“A cellular thermal shift assay for detecting amino acid sites involved in drug target engagement”的实验方案文章（Protocol）。该文章描述了一个经过优化和验证的基于配体诱导蛋白热稳定的细胞热迁移分析流程，其优势在于能够通过简单的步骤在细胞水平评估与药物-靶蛋白结合相关的氨基酸位点。自2018年以来，黄灿华教授团队已运用基于细胞热迁移分析的研究流程进行了肿瘤耐药、肺纤维化等领域的研究[4-6]。

在既往研究的基础上，研究者详细阐述了基于细胞热迁移分析检测药物-蛋白结合相关氨基酸位点的实验和分析流程（图1）。在前期研究中，作者初步确认了药物-蛋白结合相关的潜在氨基酸位点。接下来，作者构建了过表达野生型蛋白或目的氨基酸突变蛋白的HEK 293T细胞系，并给予相同时间和浓度的药物处理。随后，作者收集细胞、将多个等分的细胞悬液加热到不同温度并分离蛋白组分。最后，作者通过免疫印迹实验结合条带强度分析，对目标蛋白进行定量，从而验证目的氨基酸突变是否影响药物-蛋白结合，即评估药物-蛋白结合相关的氨基酸位点。

图1 基于细胞热迁移分析检测药物-蛋白结合位点的实验方案

（图源：Peng L, et al., STAR Protoc, 2022）

除了详细的试剂和方法，本方案也提供了具体的实验案例（图2）。在转染野生型质粒（Flag-CypA WT）的细胞中，药物处理组（Flag-CypA WT+CsA）的蛋白在加热后更稳定，表明蛋白可以与药物相互作用。然而，在转染突变质粒（Flag-CypA C2A）的细胞中，药物处理组（Flag-CypA C2A+CsA）蛋白加热后的稳定性没有发生明显变化，表明突变位点参与了蛋白和药物的结合。

图2 药物靶点结合相关氨基酸位点分析

（图源：Peng L, et al., STAR Protoc, 2022）

选择适当的药物孵育时间、药物浓度、加热温度区间和加热时间对于成功开展实验至关重要，研究者围绕这几个关键因素进行了探讨。

药物孵育时间和浓度需要根据具体的药物和蛋白进行优化。药物孵育时间一般为3-6小时。随着孵育时间和药物浓度的增加，药物与靶点的结合通常呈现增加趋势。为了确定恰当的药物浓度，可通过预实验利用不同浓度的药物处理细胞，并保持孵育时间（通常为3-6小时）、加热时间（通常为3-5分钟）和温度（通常为50℃-60℃）恒定，最终选择加热后使蛋白质显著表达的最低药物浓度。

此外，不同蛋白质或药物的加热温度区间和加热时间也应通过预实验适当优化。为了确定合适的加热温度区间，可用40℃到70℃的温度梯度加热细胞，温度间隔为2℃-3℃（此时保持孵育时间、药物浓度和加热时间恒定）。随后完成热迁移分析的全部步骤，得出熔解曲线。在后续实验中，选择蛋白质开始降解的温度作为初始温度点，蛋白质完全降解的温度作为结束温度点，正式实验的温度区间一般为5℃-7℃。加热时间的优化步骤与上述优化步骤相似，加热时间通常为3-5分钟。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该实验方案系统介绍了基于细胞热迁移分析检测药物-蛋白结合相关氨基酸位点的详细流程与优化方案，为药物机理相关研究提供了重要手段。据报道，在细胞热迁移分析实验中，分子量较大的蛋白质或蛋白质复合物可能具有较弱的配体诱导反应[3]。因此，该实验方案可能仅限于分子量较小的蛋白质。此外，在检测药物靶标结合相关的特定氨基酸位点时，我们将外源质粒转入细胞中，可能导致药物靶标结合状态与内源性蛋白有所不同。具体的实验优化与改进方法仍有待进一步研究。

原文链接: https://star-protocols.cell.com/protocols/1695

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室黄灿华教授为本文的通讯作者，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室彭李缘博士和蒋静文博士为论文的共同第一作者，其他合作者包括周立博士和Edouard C. Nice教授。

该研究获得了国家重点研发计划项目（2020YFA0509400）、广东省基础与应用基础研究重大项目（2019B030302012）、国家自然科学基金项目（81821002、82130082、81790251、82003098）和中国博士后科学基金项目（2020TQ0214、2020M673252）的资助。

黄灿华教授

（照片提供自：四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室黄灿华课题组）

通讯作者简介（上下滑动阅读）  

黄灿华，教授，博士研究生导师。国家杰出青年科学基金获得者，973计划项目首席科学家，教育部长江学者特聘教授，国家自然科学基金委创新群体项目负责人，科技部“创新人才推进计划”重点领域创新团队负责人暨中组部第四批国家“万人计划”科技创新领军人才，国务院学位委员会第八届学科评议组（基础医学组）成员，爱思唯尔中国高被引学者，教育部自然科学奖一等奖获得者。黄灿华教授团队聚焦“氧化还原信号调控与肿瘤发生发展”进行了一系列研究，在Nat Microbiol、Nat Commun、Cell Rep、Gastroenterology、J Hepatol、Hepatology、EMBO Mol Med、Cancer Res、Autophagy、Oncogene、Cell Death Differ、Mol Cell Proteomics等国际学术刊物出版论文90余篇，受邀请在Trends Biochem Sci、Signal Transduct Target Ther、Semin Cancer Biol、Drug Resist Updat、J Hematol Oncol、Mass Spectrom Rev、Antioxid Redox Signal、Med Res Rev、Biochim Biophys Acta Rev Cancer等国际学术刊物上发表多篇生物学前沿综述。欢迎各位青年才俊加入黄灿华教授课题组！（Email：[e-mail]）

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Martinez MD, Jafari R, Ignatushchenko M, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 2013. 341(6141): 84-7.

[2] Hao J. Thermal shift assay for exploring interactions between fatty acid-binding protein and inhibitors. Methods Mol. Biol. 2021. 2261: 395-409.

[3] Jafari R., Almqvist H., Axelsson H, et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nat. Protoc. 2014. 9(9): 2100-22.

[4] Peng L, Jiang J, Chen H-N, et al. Redox-sensitive cyclophilin A elicits chemoresistance through realigning cellular oxidative status in colorectal cancer. Cell Rep. 2021. 37(9): 110069.

[5] Jiang J, Zhang L, Chen H-N, et al. Regorafenib induces lethal autophagy arrest by stabilizing PSAT1 in glioblastoma. Autophagy. 2020. 16(1): 106-22.

[6] Wang K, Zhang T, Lei Y, et al. Identification of Annexin A2 as a Specific Bleomycin Target to Induce Pulmonary Fibrosis by Impeding TFEB-mediated Autophagic Flux. Autophagy. 2018. 14(2): 269-82.

本文完