EMBO Reports | 苏建国课题组揭示鲤科鱼类两种膜型TLR5感知dsRNA并产生拮抗作用

撰文︱廖志伟

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

TLR5（Toll-like receptor 5）参与病原菌感染宿主产生的免疫应答反应，Hayashi等人研究发现来源于李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的鞭毛蛋白可以激活哺乳类TLR5而引起炎症反应。Hayashi等研究人员将编码鞭毛蛋白的基因转入大肠杆菌（Escherichia coli）进行表达也可以促进TLR5产生炎症反应；而敲除鞭毛蛋白的基因后揭示其不能够活化TLR5产生免疫反应，以上结果表明哺乳类TLR5的配体为鞭毛蛋白[1]。Smith等人通过对鞭毛蛋白进行插入和缺失等研究发现其保守的13个氨基酸负责结合TLR5，该序列对鞭毛形成以及细菌运动能力都非常关键[2]。同时，大量研究发现禽类TLR5感知鞭毛蛋白后，通过诱导NF-κB入核，进而诱导炎症细胞因子产生而发挥炎性抗感染的作用[3,4]。

鱼类TLR5与哺乳类不同的是有两种形式：一种是演化保守的膜型TLR5（TLR5M），另外一种是只有胞外区的游离型TLR5（TLR5S），并且都能够识别鞭毛蛋白[5,6]。TLR5S仅存在于部分鱼类中，目前已在虹鳟、牙鲆、点带石斑鱼和大西洋鲷等鱼类中报道存在两种TLR5（TLR5M和TLR5S）[6]，但在斑马鱼、草鱼、鲫和鲤等鱼类中只存在TLR5M，还未发现TLR5S的存在[6]。在鲤科鱼类中存在两个膜型TLR5（TLR5a和TLR5b），如斑马鱼和草鱼。目前已报道斑马鱼TLR5在鞭毛蛋白刺激后能够形成异源二聚体在免疫反应中传递信号[7]。但两个膜型TLR5能否识别其它配体，能否形成同源二聚体发挥生物学功能及其下游信号传递是否存在差异仍然未知。

2022年6月3日，华中农业大学苏建国教授课题组在国际学术期刊EMBO Reports上发表了题为“Cyprinid-specific duplicated membrane TLR5 senses dsRNA as functional homodimeric receptors”的研究。该研究发现草鱼TLR5a（CiTLR5a）和TLR5b（CiTLR5b）除了形成异源二聚体识别鞭毛蛋白外，还能形成同源二聚体识别双链RNA（dsRNA）产生拮抗免疫反应。CiTLR5a、CiTLR5b识别dsRNA的关键结合位点存在差异性。CiTLR5a、CiTLR5b的功能还受N-糖基化修饰的调控。从鱼类到哺乳类，仅仅鲤科鱼类来源的TLR5能够识别dsRNA。本研究解析了CiTLR5a、CiTLR5b在不同配体识别过程中的免疫调节通路。

1. CiTLR5a与CiTLR5b识别鞭毛蛋白与dsRNA

TLR5作为重要的先天性免疫传感器而识别细菌鞭毛蛋白[8]。恒温动物（哺乳类和鸟类）有一个TLR5同源物，通过形成同源二聚体监测鞭毛蛋白[9]。而硬骨鱼由于复制或重组而具有多种TLR5类型[6]。例如，斑马鱼和草鱼有两种膜型TLR5（TLR5a和TLR5b）[10]。斑马鱼TLR5对鞭毛蛋白的反应是DrTLR5a和DrTLR5b形成异源二聚体[7]。DrTLR5b-鞭毛蛋白复合物的晶体结构为TLR5同源二聚作用模型提供了结构支撑[11]。然而DrTLR5a识别鞭毛蛋白的直接证据并不存在。研究人员发现CiTLR5a和CiTLR5b都能在体外结合鞭毛蛋白。当CiTLR5a和CiTLR5b分别过表达时，使用纯化的鞭毛蛋白或鞭毛菌裂解液不能激活NF-κB2。当CiTLR5a和CiTLR5b共同过表达时，使用纯化的鞭毛蛋白或鞭毛菌裂解液能够激活NF-κB2。此外，CiUNC93B1通过异源二聚体增强NF-κB2启动子活性。相反，CiTLR5a和CiTLR5b作为同源二聚体分别在dsRNA [poly(I:C)和GCRV]反应中发挥相反的作用。鉴于TLR具有二聚体的功能[12]，研究人员揭示了CiTLR5a和CiTLR5b作为异源二聚体感知鞭毛蛋白，CiTLR5a和CiTLR5b分别作为同源二聚体感知dsRNA（图1）。

图1 CiTLR5a和CiTLR5b作为异源二聚体感知鞭毛蛋白，作为同源二聚体感知dsRNA

（图源：Liao et al., EMBO Reports, 2022）

2. CiTLR5a与CiTLR5b在病毒免疫反应中起拮抗作用

TLR5a和TLR5b能有效监测细菌中的鞭毛蛋白和病毒中的dsRNA。这两种配体（鞭毛蛋白和dsRNA）诱导不同的二聚体反应。研究人员发现鞭毛蛋白诱导CiTLR5a和CiTLR5b形成异源二聚体，而dsRNA诱导CiTLR5a和CiTLR5b形成同源二聚体。根据CiTLR5a、CiTLR5b过表达和RNA干扰（RNAi）实验的结果，证明了CiTLR5a在抗病毒反应中具有强有力的稳态作用（图2）。CiTLR5b胞外结构域同源二聚体是必需的，而CiTLR5a的胞外结构域在诱导IFN反应中显示出轻微的促病毒和强有力的内稳态功能。同时CiTLR5a和CiTLR5b胞外结构域和胞内结构域异源二聚体感知鞭毛蛋白激活NF-κB2反应是必要的。本研究首次证明了TLR5a与TLR5b可以形成同源二聚体感知dsRNA，并产生相反的抗病毒反应。这开启了一种新的机制，TLR5可以增加它们在病原体中监测微生物相关分子模式的能力。

图2 CiTLR5a和CiTLR5b作为同源二聚体感知dsRNA并产生拮抗作用

（图源：Liao et al., EMBO Reports, 2022）

3. CiTLR5a、CiTLR5b识别dsRNA的位点具有序列特异性

为了确定CiTLR5a和CiTLR5b中的poly(I:C)结合位点，研究人员分别在CiTLR5a和CiTLR5b中突变了9个和6个预测的poly(I:C)结合位点。值得注意的是，只有CiTLR5a-G240A增加了IFN1启动子的活性，而CiTLR5b-N547A在poly(I:C)刺激后对IFN1启动子的活性降低。CiTLR5a-G240A、CiTLR5b-N547A与poly(I:C)的结合能力都减弱了。而用丙氨酸取代CiTLR5b-G238（对应的CiTLR5a-G240）和CiTLR5a-N548（对应的CiTLR5b-N547）对IFN1启动子活性和poly(I:C)结合能力没有显著影响（图3）。这些结果表明TLR5a、TLR5b结合dsRNA位点具有序列特异性。

图3 CiTLR5a、CiTLR5b感知poly(I:C)关键位点

（图源：Liao et al., EMBO Reports, 2022）

4. CiTLR5a与CiTLR5b功能受N-糖基化修饰调控

N-糖基化修饰对膜蛋白折叠、稳定性和其他细胞功能至关重要[13]。CiTLR5a和CiTLR5b的N-糖基化修饰显著影响其分子量和功能。天然CiTLR5a（11个潜在的N-糖基化位点）的分子量大于CiTLR5b（7个潜在的N-糖基化位点），且两者均大于其理论分子量。经Endo H处理后，分子量基本恢复到理论值。此外，用N-糖基化抑制剂衣霉素处理后可消除对poly(I:C)和鞭毛蛋白刺激后产生的免疫反应。特定的N-糖基化位点（CiTLR5a-T101，对应的CiTLR5b-I99）可以导致IFN信号功能的逆转，但不影响配体结合（鞭毛蛋白和poly(I:C)）（图4）。N-糖基化位点CiTLR5a-T101和相应的CiTLR5b-I99有助于抗病毒反应中的拮抗作用。这些结果表明关键的N-糖基化位点导致了功能的显著改变。N-糖基化不会引起蛋白质结构的显著变化，但会降低蛋白质的动力学，可能导致蛋白质稳定性的增加[14]。这个相应位点的N-糖基化降低抗病毒免疫反应，这可能是由于蛋白质动态减少造成的。

图4 CiTLR5a和CiTLR5b的N-糖基化修饰位点鉴定及其功能解析

（图源：Liao et al., EMBO Reports, 2022）

5. 鲤科鱼类两种膜型TLR5识别dsRNA

在草鱼和斑马鱼（两者都是鲤科动物）中，TLR5a和TLR5b作为同源二聚体感知dsRNA并产生拮抗反应。DsRNA由正链RNA、dsRNA和DNA病毒产生，但不能由负链RNA病毒产生[15]。CiTLR5a和CiTLR5b可能源于串联基因复制产生。原始硬骨鱼和恒温动物（哺乳类和鸟类）有一个TLR5同源物，这意味着TLR5起源于一个TLR5同源物，它作为同源二聚体来感知鞭毛蛋白（图5）。与斑马鱼相似，CiTLR5a和CiTLR5b也经历了亚功能分化而作为异源二聚体来感知鞭毛蛋白[7]。出乎意料的是，CiTLR5a、CiTLR5b、DrTLR5a和DrTLR5b以同源二聚体的形式表现出新功能化来感知dsRNA。草鱼和斑马鱼的TLR5感知dsRNA是硬骨鱼TLR新功能的第一个例子。根据这种模式，其他重复的基因可能在演化中产生新的功能。这可以部分解释了哺乳动物TLR2同源二聚体和异源二聚体的配体多样性。

图5 不同代表物种TLR5的种类和功能分析

（图源：Liao et al., EMBO Reports, 2022）

图6 CiTLR5a和CiTLR5b配体识别及其调控模型

（图源：Liao et al., EMBO Reports, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

TLR5在演化过程中经历了原始M型（雀鳝）、复制M/M型（鲤科鱼）、过渡M/M/S型（斑点叉尾鮰）、协同M/S型（虹鳟、非洲爪蛙和安乐蜥）和普通M型（恒温动物）。鲤科鱼类特异性TLR5（M/M型）表现出的新功能，可以作为同源二聚体感知病毒dsRNA并产生拮抗作用，它们也可以亚功能化作为异源二聚体感知细菌鞭毛蛋白。TLR5a与TLR5b在酸性的早期内体和溶酶体中，作为同源二聚体感知dsRNA，异源二聚体感知鞭毛蛋白进而产生信号传递。从结构上看，TLR5a、TLR5b具有保守的鞭毛蛋白结合区域和位点，容易通过同源二聚体和异源二聚体结合鞭毛蛋白，但只有异源二聚体结合鞭毛蛋白才能激活免疫应答。dsRNA与TLR5a胞外结构域的前中部结合，而与TLR5b胞外结构域的末端结合，因此它们仅通过同源二聚体与dsRNA结合，将dsRNA钳住在相同的位置进而触发免疫应答。在TLR5a与TLR5b中，dsRNA的关键结合位点具有序列特异性和物种特异性。CiTLR5a具有轻微的负调控作用和强大的稳态作用，而CiTLR5b在抗病毒反应中发挥强有力的正调控作用，其主要由一个关键的N-糖基化位点（CiTLR5a-T101，对应的CiTLR5b-I99）和一个关键的poly(I:C)结合位点（CiTLR5a-G240, CiTLR5b-N547）控制（图6）。这些发现连接了抗病毒和抗细菌的免疫反应，加深了对配体诱导的TLR激活机制的理解，为复制基因的新功能化提供了一个例证。

原文链接：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202154281

本论文得到了国家自然科学基金面上项目、重点项目和国家重点研发计划“蓝色粮仓”项目的资助。

 第一作者廖志伟（左），通讯作者苏建国（右）

（照片提供自：华中农业大学水产学院苏建国实验室）

作者简介：本文第一作者是华中农业大学水产学院博士研究生廖志伟，通讯作者是华中农业大学水产学院苏建国教授。华中农业大学杨春荣老师，博士研究生蒋锐、朱文涛参与了部分研究工作。华中农业大学张永安教授对本研究给予了大力支持和指导。该团队从2006年开始，长期围绕鲤科鱼类TLR家族开展研究，相关研究成果发表于EMBO Reports、The Journal of Immunology等刊物。

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本文完