Cell Reports︱时毅团队等合作揭示基于广谱抗病毒纳米抗体的免疫机制

撰文︱桑喆，向宇菲

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）仍旧在全球肆虐。自2019年底至今，超过5亿人感染。同时，在与人体免疫系统的博弈中，病毒持续的变异。最新的奥密克戎（Omicron）变异株能够高效突破接种疫苗所介导的免疫屏障，并在人群中快速传播。疫情对人类健康，生活，以及社会经济和政治带来前所未有的挑战。

SARS系列冠状病毒(SARS-like viruses or Sarbecoviruses)具有高度的遗传多样性。目前已经发现了包括SARS-CoV （萨斯病毒-爆发于2002年），ARS-CoV-2在内的几十个亚种。频繁的基因重组，广泛的自然宿主（如蝙蝠等)以及人类对野生动物栖息地的不断侵蚀（如中国云南、印度、东南亚等），极大地增加了病毒感染人类的风险。

面对不断演化的疫情以及未来新型病毒对人类的长期威胁，研发高效广谱抗病毒药物迫在眉睫。最新的研究表明，人体B细胞在感染后（或者先感染后注射疫苗）会持续的进化，产生能够抵SARS-CoV-2 突变的抗体。然而，对于这种“超级免疫”(SARS-CoV-2 super immunity)[1]的作用机理我们目前知之甚少。形成超级免疫的广谱抗体至今还没有在血液里被系统的分离研究。

纳米抗体因为其小分子量，高稳定性和水溶性，以及容易改造等特点近来受到科学和医药领域的广泛关注。目前已有2种纳米抗体药物被美国食品药品监督局 (FDA) 批准，同时越来越多的基于纳米抗体的治疗/诊断进入临床试验。稳定的纳米抗体可以通过气化喷雾直接吸入，用于治疗病毒引起的肺部感染。改造后的纳米抗体多聚体会显著增强对病毒突变的保护。因此，纳米抗体的研究对广谱抗病毒药物的研发以及更好地理解超级免疫的机制意义深远。

2022年6月8日，原匹兹堡大学医学院、现西奈山伊坎医学院时毅教授，凯斯西储大学Derek J. Taylor教授及斯克里普斯研究所Ian A. Wilson教授团队合作在国际学术期刊 Cell Reports 上在线发表了题为“Super-immunity by pan-sarbecovirus nanobodies” 的论文[2]。通过对驼羊用SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike)的受体结合域（RBD）蛋白进行连续免疫，研究人员发现免疫驼羊的血液里产生了超级免疫反应。时毅团队利用其早先开发的先进的蛋白质组学抗体平台[3]迅速鉴定了上千种广谱抗冠状病毒纳米抗体，分离、表达并系统地试验评估了100个多样化，高亲和的广谱纳米抗体（pan-sarbecovirus nanobodies，psNbs）。和以往发现的纳米抗体不同，psNbs高亲和力地靶向结合本研究测试的至少19种萨斯类病毒的 ，而且能够在极低浓度下（最低均值浓度 IC₅₀=1.2 ng/ml）中和新冠病毒及其所有变种。通过冷冻电镜和X射线晶体学等结构生物学技术，团队解析了13个广谱纳米抗体和刺突蛋白（或RBD) 复合物的分子结构，系统的比较了它们和普通新冠纳米抗体的区别。根据结构分析，团队还设计了一种双特异性广谱纳米抗体用来高效中和各种萨斯类病毒。这项研究有助我们更好的理解广谱纳米抗体的抗病毒分子机制以及超级免疫演变的潜在规律。

新证据表明，疫苗加强针或新冠感染可以使人体内SARS-CoV-2抗体进一步提高其中和病毒效力和广度。在这项研究中，课题组在连续多次免疫的驼羊血液里惊奇地观察到“超级免疫”的抗病毒活性。利用全新的蛋白组学纳米抗体筛选平台[3]，时毅团队从血清中快速分离鉴定了上千种超高亲和力、广谱抗病毒纳米抗体 (psNbs)。随后研究人员分离表达并且系统的试验评估了100种多样化的psNbs。这些psNb对 目前所有的SARS-CoV-2 变种（VOCs）及其他近亲病毒高度有效（图1）。其中最佳的psNbs能在极低浓度情况下中和致病的萨斯类病毒包括SARS-CoV-2的所有变种以及SARS-CoV。研究发现，这些罕见的psNbs能与各种萨斯类病（包括19种sarbecoviruses亚种) 高效结合。同时其针对RBD的高亲和力和特异性避免了它们非靶向结合人类细胞进而产生副作用（图2）。

图1 广谱纳米抗体的发现、鉴定与评估

（图源：Xiang, et al., Cell Reports, 2022）

图2 17个具代表性、高多样性广谱抗病毒纳米抗体与病毒的结合、中和实验

（图源：Xiang, et al., Cell Reports, 2022）

为了更好地理解这些特殊纳米抗体的广谱抗病毒分子机制，结构生物学家Derek J. Taylor 博士及 Ian.A.Wilson 博士团队合计解析了13个psNbs和刺突蛋白（或RBD) 复合物的分子结构。这些接近原子分辨率的高清晰结构揭示了RBD上存在至少五类广谱中和表位(broadly neutralizing epitopes)。psNbs通常结合病毒高度保守的区域。这些相对保守区域对病毒结构（比如稳定性）尤为重要，因此难以出现大规模突变。其中一类psNbs（第一类）能够结合特异性高（低保守度）的受体结合的区域。此类psNbs具有最强大的中和病毒能力。其他四类psNbs结合RBD上多种表位，其中很多表位是首次在纳米抗体中被发现。研究同时揭示了psNbs丰富的结构多样性，13种 psNbs 结构覆盖了超过75%的RBD表面保守序列。毫无疑问，psNbs结合保守序列的特点，多元化的结构以及结合表位对于对抗未来可能出现的病毒突变至关重要。此外，根据结构分析，研究人员还开发了一种高效稳定、可吸入和双特异性抗体PiN-31（可结合RBD表面两个独立的高度保守区域），证明了纳米抗体容易改造以及体内试验的高潜力。

图3 广谱中和表位和刺突蛋白的构象

（图源：Xiang, et al., Cell Reports, 2022）

通过分析和比较包括已有的普通新冠纳米抗体结构，研究人员首次揭示了纳米抗体从高特异性向广谱抗病毒演变（超级免疫）的潜在机理（图3）。同普通纳米抗体相比，高度进化的广谱纳米抗体能更好的靶向结合面积小、平滑和结构相对灵活的病毒结合表位。同时，研究揭示了高亲和性的广谱纳米抗体中和病毒的效果与其表位到 hACE2 受体结合位点 (RBS) 的距离呈现出了非常明显的负相关（图4）-其结合区域离 RBS 越近抗病毒效果越好。最新的病毒突变株 (奥密克戎/Omicron) 不仅仅在 RBS 积累了大量的突变，同时有向保守区域突变的倾向。有趣的是，多次免疫后，驼羊的纳米抗体也会从RBS区域向保守区域集结及亲和成熟。这种趋同变化暗示了病毒突变和哺乳动物抗体免疫的关系。病毒刺突蛋白表面的结构化学特性似乎决定了这种趋同变化。理解这种机制会帮助广谱疫苗和抗病毒药物的研发。

图4 广谱中和的作用机理

（图源：Xiang, et al., Cell Reports, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究为基于广谱纳米抗体的“超级免疫”进化提供了分子机制。研究者发现、评估了大量对类SARS冠状病毒有效的广谱纳米抗体（psNbs），继而测定了13个高分辨率的纳米抗体与病毒刺突蛋白（spike）或受体结合域（RBD）的复合物结构。这些数据为研究纳米抗体的广谱抗病毒活性提供了分子层面的理论基础。免疫原性飘移（antigenic shift）以及病毒与宿主免疫之间的“竞赛“有可能驱动抗体进化。此前，时毅博士团队已在Science、Science Advances、Nature Communications等多个杂志发表研究结果，证明了能在体外高效中和病毒的纳米抗体也能在感染新冠病毒的仓鼠体内高效中和病毒，起到预防及治疗的作用[4-6]。同时，该团队也研发出了能在保证纳米抗体特性情况下快速人源化纳米抗体的软件Llamanade [7]。研究组未来将系统性地工程化改造和评估广谱纳米抗体的多聚体，通过结合RBD上不同的广谱中和表位进一步增强亲和性和广度，从而应对当前及未来可能出现的病毒变种。最后在鼠类，灵长类等动物模型中系统性测试这些广谱纳米抗体多聚体对不同的SARS类病毒的有效性，并评估诸如雾化吸入等多种给药策略，以期将广谱抗SARS类病毒抗体药物推向临床试验。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124722007938

论文共同第一作者为向宇菲 (西奈山医学院/匹兹堡大学)、黄围博士(凯斯西储大学)、刘合军博士 (斯克里普斯研究所)、以及桑喆(西奈山医学院/匹兹堡大学)。其他作者包括Sham Nambulli博士（匹兹堡大学）、Jerome Tubiana 博士（以色利特拉维夫大学）、W Paul Duprex博士 (匹兹堡大学)、Dina Schneidman-Duhovny博士 (以色利耶路撒冷大学)、Ian A. Wilson院士 (斯克里普斯研究所), Derek J. Taylor博士 (凯斯西储大学)。文章的通讯作者为时毅博士（西奈山医学院/匹兹堡大学）。

时毅实验室2019年合照

（照片提供自：时毅实验室）

作者简介（上下滑动阅读）  

时毅博士于2017初在匹兹堡大学建立实验室。2022年实验室搬至纽约西奈山医学院 （Icahn School of Medicine at Mount Sinai）。时毅博士现任药理科学系（Pharmacological Sciences）副教授（终身），兼任 Protein Engineering and Therapeutics 中心主任。实验室致力于质谱/蛋白质组学以及蛋白质新药的技术研发。此前，实验室在利用多维生物质谱技术和计算、结构生物前沿技术鉴定研发纳米抗体药物上取得了突破性的成果。目前实验室利用计算机/机器学习、蛋白质组学及结构生物学研发新型抗体药物及疫苗。详细研究内容可了解实验室网站：https://www.shi-lab.org/

实验室在“大苹果”纽约市曼哈顿上东，经费充足，氛围良好，合作广泛，支持创新研究和职业发展。现诚招有共同研究兴趣的博士后、研究生及研究助理。研究背景：蛋白质谱学、免疫学（倾向于有动物模型经验）、微生物学、或结构生物学。实验室支持签证申请。感兴趣的同学可以直接联系时博士申请：[e-mail]或 [e-mail]

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Callaway E. COVID super-immunity: one of the pandemic's great puzzles. Nature. 2021; 598(7881):393-4. doi: 10.1038/d41586-021-02795-x.

[2] Xiang Y, Huang W, Liu H, Sang Z, Nambulli S, Tubiana J, Williams KL, Duprex WP, Schneidman-Duhovny D,Wilson IA, Taylor DJ, Shi Y. Super-immunity by pan-sarbecovirus nanobodies. Cell Reports. 2022,https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111004.

[3] Xiang Y, Sang Z, Bitton L, Xu J, Liu Y, Schneidman-Duhovny D, Shi Y. Integrative proteo mics identifies thousands of distinct, multi-epitope, and high-affinity nanobodies. Cell Syst. 2021;12(3):220-34 e9. doi: 10.1016/j.cels.2021.01.003.

[4] Xiang Y, Nambulli S, Xiao Z, Liu H, Sang Z, Duprex WP, Schneidman-Duhovny D, Zhang C, Shi Y. Versatile and multivalent nanobodies efficiently neutralize SARS-CoV-2. Science. 2020;370(6523):1479-84. doi: 10.1126/science.abe4747.

[5] Nambulli S, Xiang Y, Tilston-Lunel NL, Rennick LJ, Sang Z, Klimstra WB, Reed DS, Crossland NA, Shi Y, Duprex WP. Inhalable Nanobody (PiN-21) prevents and treats SARS-CoV-2 infections in Syrian hamsters at ultra-low doses. Sci Adv. 2021;7(22). doi: 10.1126/sciadv.abh0319.

[6] Sun D, Sang Z, Kim YJ, Xiang Y, Cohen T, Belford AK, Huet A, Conway JF, Sun J, Taylor DJ, Schneidman-Duhovny D, Zhang C, Huang W, Shi Y. Potent neutralizing nanobodies resist convergent circulating variants of SARS-CoV-2 by targeting diverse and conserved epitopes. Nat Commun. 2021;12(1):4676. doi: 10.1038/s41467-021-24963-3.

[7]  Sang Z, Xiang Y, Bahar I, Shi Y. Llamanade: An open-source computational pipeline for robust nanobody humanization. Structure.2022;30(3):418-29 e3. doi:10.1016/j.str.2021.11.006.

本文完