Mol Ther Oncolytics︱李鹏/李扬秋团队发现增强CAR-T细胞靶向异质性肿瘤的新方法

撰文︱李尚霖，赵若聪

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

尽管嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T cells）疗法在血液肿瘤的临床治疗中展现出了令人欣喜的疗效[1]，但现阶段CAR-T细胞疗法对实体肿瘤总体疗效不佳。抗原表达异质性是制约CAR-T细胞杀伤实体肿瘤的重要因素之一，随时空变化而表达不一的肿瘤抗原给CAR-T细胞治疗实体瘤带来了巨大的挑战[2]。所以，增强CAR-T细胞对异质性肿瘤细胞的识别杀伤能力具有重要的临床意义。

近日，中科院广州生物医药与健康院李鹏研究员、暨南大学李扬秋教授课题组合作在Molecular Therapy – Oncolytics发表了题为“DAP10 integration in CAR-T cells enhances the killing of heterogeneous tumors by harnessing endogenous NKG2D”的研究论文。该研究揭示调动T细胞内源性NKG2D受体能够增强CAR-T细胞杀伤异质性肿瘤活性，为增强CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效提供了新的策略。（拓展阅读：李鹏课题组最新研究进展，详见“岚翰模式科学”报道（点击阅读）：Frontiers Immunol︱李鹏团队揭示CCR8可作为治疗T细胞恶性肿瘤潜在的治疗靶点）

1.设计和评估可调动T细胞内源性NKG2D发挥广谱抗肿瘤功能的DAP10BBz分子

NKG2D受体（natural killer group 2D）作为NK细胞中的激活性受体，因其具有多种肿瘤配体的识别能力受到了免疫学家的广泛关注[3]。虽然该受体也表达于CD8+的T细胞中，但是天然状态下NKG2D受体识别抗原后并不能直接激活CD8+T细胞，其仅作为T细胞的共刺激信号受体参与T细胞的信号调控[4]。课题组将负责传导NKG2D受体信号的配体分子DAP10（DNAX-activating protein 10）串联4-1BB和CD3z的嵌合分子，构建出了DAP10BBz嵌合分子，将该分子转导入人原代T细胞中后发现可以提升CD8+ T细胞中天然NKG2D的表达量。通过体外肿瘤共培养实验发现转导了该分子的T细胞（DAP10-T）可以对多种表达NKG2D配体的肿瘤细胞产生识别杀伤作用，对多种肿瘤的靶向作用均强于阴性对照细胞CAR19-T（anti-CD19 CAR-T）。随后的研究证明DAP10-T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤是由CD8+ T细胞的内源性NKG2D受体所介导，因为当该受体被抗体阻断后，DAP10-T的杀伤作用会被随之阻断。因此通过将DAP10串联T细胞激活信号分子后可以调动CD8+ T细胞内源的NKG2D受体对肿瘤靶细胞产生识别和杀伤作用（图1）。

图1 调动内源NKG2D广谱杀伤多种肿瘤细胞

（图源：Li SL, et al., Mol Ther Oncolytics, 2022）

2. 整合DAP10分子能增强传统抗GPC3 CAR-T细胞对NKG2D配体阳性肿瘤细胞的识别能力

基于以上实验结果，借鉴已有的串联双靶点CAR分子设计思路，研究人员猜想将DAP10分子替换传统CAR分子内的跨膜结构域，能否增强CAR-T细胞识别NKG2D配体阳性肿瘤细胞的能力，从而实现CAR-T细胞在靶向肿瘤相关抗原的同时又能识别表达NKG2D配体的肿瘤细胞。研究人员随后构建了靶向磷脂酰肌醇聚糖3（Glypican 3，GPC3）并串联DAP10和其他胞内激活信号域的双功能CAR分子（GPC3-DAP10 CAR）将其转导入T细胞后得到GPC3-DAP10-T细胞。随后将GPC3-DAP10-T细胞同表达GPC3抗原的细胞系（Huh7）或者表达NKG2D配体的细胞系（Sk-Hep1）共培养后，发现该新型CAR-T细胞具备杀伤表达GPC3抗原或者表达NKG2D配体的肿瘤细胞的能力。研究者对体外杀伤肿瘤细胞后的培养基上清进行细胞因子鉴定，发现GPC3-DAP10-T可以被GPC3抗原或者NKG2D配体激活以分泌更多的细胞因子（白介素2、干扰素γ、颗粒酶B）。以上实验证明了整合DAP10分子能增强传统抗GPC3 CAR-T细胞对NKG2D配体阳性肿瘤细胞的识别能力。

3. GPC3-DAP10-T细胞具有显著增强的靶向异质性肿瘤细胞活性

研究人员随后猜测，新型GPC3-DAP10-T细胞可能对抗原表达异质性的实体肿瘤产生有效的靶向识别作用。为了模拟和监测异质性肿瘤细胞群体，研究人员对野生型Sk-Hep1细胞（不表达GPC3抗原）过表达GPC3抗原和tdTomato红色荧光蛋白，形成GPC3+tdTOmato+的细胞系；同时对野生型Sk-Hep1细胞过表达EGFP绿色荧光蛋白，形成GPC3-EGFP+的细胞系。将两种抗原表达和蛋白标记不同的Sk-Hep1细胞混合后与CAR-T细胞共培养，随后对存活的肿瘤细胞进行荧光成像。结果显示GPC3-DAP10-T细胞能够同时有效杀伤红色荧光标记和绿色荧光标记的肿瘤细胞，而传统抗CAR GPC3-T细胞仅能对红色荧光标记的肿瘤细胞产生杀伤作用。统计结果显示，传统的CAR GPC3-T仅能清除表达GPC3的肿瘤，从而造成抗原阴性的肿瘤细胞免疫逃逸，而GPC3-DAP10-T细胞可以对抗原表达异质性的肿瘤细胞群发挥显著的清除作用（图2）。

图2 GPC3-DAP10-T细胞清除异质性肿瘤

（图源：Li SL, et al., Mol Ther Oncolytics, 2022）

研究人员进一步在免疫缺陷鼠（NSI）[5]中构建混合Sk-Hep1的异质性肿瘤模型，用以评估GPC3-DAP10-T细胞在体内清除异质性肿瘤的效果。对建模成功的小鼠尾静脉回输CAR-T细胞后，定时连续测量肿瘤大小，并绘制出的肿瘤生长曲线。结果看到，相比传统CAR-T细胞，GPC3-DAP10-T细胞对异质性肿瘤表现出更强的体内抑制作用。从安乐死的小鼠皮下取出肿瘤后，对其称量重量后进行统计，瘤重结果同肿瘤生长曲线保持一致，说明GPC3-DAP10-T细胞在小鼠体内有更强的靶向和抑制异质性实体肿瘤的能力（图3）。

图3 GPC3-DAP10-T细胞在小鼠体内抑制异质性肿瘤生长

（图源：Li SL, et al., Mol Ther Oncolytics, 2022）

图4 CAR GPC3-DAP10-T cells靶向异质性肿瘤概念图

（图源：Li SL, et al., Mol Ther Oncolytics, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究借鉴现有串联双靶点CAR分子的设计思路[6, 7]，将GPC3-CAR与NKG2D识别元件联合从而形成双功能嵌合受体，通过体外和体内功能实验证明了该CAR-T细胞比传统靶向GPC3抗原的CAR-T细胞具有更强的杀伤异质性肿瘤活性，可以有效抑制实体肿瘤细胞的抗原逃逸。值得注意的是，由于NKG2D蛋白是一个二型膜蛋白[8]，传统CAR分子的原件均为一型膜蛋白，将NKG2D受体的胞外识别域和传统CAR分子简单串联可能无法发挥嵌合受体的功能，课题组研究人员巧妙利用DAP10分子和NKG2D受体的关系，在CAR分子中引入DAP10分子后，实现了将NKG2D受体与特定靶点的CAR分子联合的设计思路，从而为增强CAR-T细胞靶向异质性实体肿瘤提供了新的策略（图4）。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.omto.2022.06.003

李鹏（左），李扬秋（右）

（照片提供自：李鹏/李扬秋团队)

作者简介（上下滑动阅读）

李鹏，研究员，博士生导师。现任中国科学院广州生物医药与健康研究院细胞再生与生物治疗研究中心研究员、中心主任。科技部中国-新西兰生物医药与健康“一带一路”联合实验室常务副主任。长期致力于肿瘤免疫治疗领域的研究，具体包括新型CAR T细胞研发、新型人源化小鼠模型构建以及CAR T细胞抗肿瘤的临床转化研究等。李鹏研究员作为第一作者或通讯作者在Science、Leukemia、Haematologica、EMBO rep、Mol Cancer、J Hematol Oncol等国际学术期刊发表SCI文章39篇。以第一发明人申请发明专利24项，其中授权专利12项，PCT专利2项，外国专利3项。曾获2019年广东省科技进步二等奖（第一完成人）（2020.02）、2017年广东省“特支计划”科技创新领军人才（2018.07）、第十九届中国优秀专利奖（第一发明人）（2017.12）、第四届广东省优秀专利奖（第一发明人）（2017.12）、新西兰国际领军人才奖（2017.09）“等荣誉。近年来，李鹏研究员承担了国家重点研发计划-战略性科技创新合作项目、国家自然科学基金国际合作研究项目、国家自然科学基金优秀青年项目、广东省自然科学基金杰出青年项目、广东省新药创制项目、中国科学院战略性先导科技专项B类项目以及广东省重点领域研发计划项目等。

李扬秋，研究员，博士生导师。现任暨南大学，医学院血液病研究所所长，暨南大学Ⅱ教授，广东省“千、百、十”工程国家级培养对象，从事T细胞受体基因重排和白血病T细胞免疫治疗相关基础研究工作。承担国家自然科学基金、863计划、广东省自然科学基金重点项目等60多项。曾获省部级等科学技术一等、二等和三等奖，发表第一作者和通讯作者SCI收录论文80多篇，主编专著2部，授权发明专利7项

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参考文献（上下滑动阅读）

1. Anagnostou, T.,Riaz, IB.,Hashmi, SK.,Murad, MH, and Kenderian, SS (2020). Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematol 7: e816-e826.

2. Rafiq, S.,Hackett, CS, and Brentjens, RJ (2020). Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol 17: 147-167.

3. Lanier, LL (2005). NK cell recognition. Annu Rev Immunol 23: 225-274.

4. Prajapati, K.,Perez, C.,Rojas, LBP.,Burke, B, and Guevara-Patino, JA (2018). Functions of NKG2D in CD8 T cells: an opportunity for immunotherapy. Cell Mol Immunol 15: 470-479.

5. Ye, W.,Jiang, Z.,Li, G-X.,Xiao, Y.,Lin, S.,Lai, Y.,Wang, S.,Li, B.,Jia, B.,Li, Y, et al. (2015). Quantitative evaluation of the immunodeficiency of a mouse strain by tumor engraftments. Journal of Hematology & Oncology 8: 59.

6. Tong, C.,Zhang, Y.,Liu, Y.,Ji, X.,Zhang, W.,Guo, Y.,Han, X.,Ti, D.,Dai, H.,Wang, C, et al. (2020). Optimized tandem CD19/CD20 CAR-engineered T cells in refractory/relapsed B-cell lymphoma. Blood 136: 1632-1644.

7. Hong, M.,Clubb, JD, and Chen, YY (2020). Engineering CAR-T Cells for Next-Generation Cancer Therapy. Cancer Cell 38: 473-488.

8. Sentman, CL, and Meehan, KR (2014). NKG2D CARs as cell therapy for cancer. Cancer J 20: 156-159.

本文完