Cell Death Dis︱邹晓平/陆云杰团队合作发现肝再生新机制

撰文︱孙   涛

责编︱王思珍

制版︱查佳雪

肝再生主要是由肝细胞介导的，肝细胞退出静止状态，在广泛的刺激下恢复活跃的增殖。肝再生是一个重要的病理生理过程，有助于各种损伤后肝功能的恢复。肝脏再生不足是肝功能衰竭的主要潜在原因。然而，受损肝脏的自我恢复能力很难说是一个肝细胞自主的过程。相反，包括肝星状细胞、肝窦内皮细胞（LSECs）和免疫细胞在内的多种细胞系有助于肝脏再生。近年来有研究表明驻留在肝内的免疫细胞如巨噬细胞、自然杀伤细胞（NKCs）对肝再生具有调控作用，然而它们对肝脏再生的具体作用机制并不明确，深入了解相关免疫细胞促进肝脏再生的机制仍不明确，深入研究免疫细胞在肝再生过程中的作用机制可以为肝损伤治疗和预防开辟一条新的道路。

2022年5月25日，常州市第一人民医院陆云杰博士、南京鼓楼医院邹晓平教授合作在Cell Death & Disease（JCR一区）上发表了题为“Trans-activation of eotaxin-1 by Brg1 contributes to liver regeneration”的研究。揭示了肝细胞中嗜酸粒细胞趋化蛋白的转录激活机制，通过促进嗜酸性粒细胞归巢协助肝再生。

肝再生是一个重要的病理生理过程，有助于各种损伤后肝功能的恢复。肝再生不足是肝功能衰竭的主要潜在原因之一，受损肝脏的自我恢复能力并不是一个肝细胞自主的过程，相反，包括肝星状细胞、肝窦内皮细胞（LSECs）和免疫细胞在内的多种细胞系有助于肝脏再生[1]。Jacquelyn Maher等的研究表明，LSECs是肝细胞生长因子的主要来源，这些生长因子对于肝再生过程中肝细胞重新进入细胞周期是必不可少的[2]。巨噬细胞及自然杀伤细胞（NKCs）对肝脏再生的贡献是不确定的，有报道表明它们既有促肝脏再生作用，也有抗再生作用[3-7]。

嗜酸性粒细胞是骨髓源性粒细胞的一个亚群。目前越来越多的证据表明，嗜酸性粒细胞在维持包括肝脏在内的内部稳态中的作用要广泛得多[8]。在生理条件下，嗜酸性粒细胞在肝脏中的表达不足，约占髓系细胞总数的1%[9]。在各种有害信号的作用下，嗜酸性粒细胞迁移到肝脏并在肝脏中积聚，以促进肝脏再生[10]。更值得注意的是嗜酸性粒细胞已被证明能促进心脏、肺上皮、角膜上皮和肌肉的再生反应[11-14]。

嗜酸性粒细胞的聚集受嗜酸性粒细胞趋化因子家族的控制，包括嗜酸性粒细胞趋化因子-1（CCL11，以下简称eotaxin（嗜酸性粒细胞趋化因子））、CCL24和CCL26。嗜酸性粒细胞趋化蛋白由威廉姆斯实验室首次分离和鉴定，是一种由73个氨基酸组成的多肽[15]。自那以后，一些研究证明了嗜酸性粒细胞趋化和疾病发病机制中嗜酸性粒细胞趋化的重要性[16-19]。慢性肝病患者和药物性肝病患者的血浆嗜酸性粒细胞趋化蛋白水平均有升高。嗜酸性粒细胞趋化蛋白在肝脏再生过程中的表达调控尚不清楚。

BRG1是哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合体的组成部分，在肝脏不同类型的细胞中大量表达。在此之前，研究者已经证明brg1缺陷导致小鼠肝再生受损，归因于Wnt-β-catenin信号的中断和延迟的肝细胞增殖[20]。在本研究中，研究者研究了BRG1对嗜酸性粒细胞趋化蛋白的转录调控。数据表明，BRG1与NF-κB/P65相互作用，激活肝细胞中嗜酸粒细胞趋化蛋白的转录，从而促进嗜酸性粒细胞归巢。

1.在小鼠肝再生过程中，嗜酸性粒细胞趋化因子表达上调

根据既往报道，在肝再生过程中肝内嗜酸性粒细胞的丰度增加，因此研究者推测可能在嗜酸性粒细胞聚集的过程中伴随着嗜酸性粒细胞趋化因子水平的增加。为验证这一假设，研究者建立了肝部分切除（2/3PHx）模型及乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤模型，ELISA实验检测到两种小鼠模型在肝再生早期嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）迅速上升，而eotaxin-2及eotaxin-3的表达未见明显变化。且嗜酸性粒细胞趋化蛋白-1表达的变化与增殖标记物增殖细胞核抗原和嗜酸性粒细胞衍生细胞因子IL-4有很好的相关性。（图1A-D）在肝细胞生长因子（HGF，一种典型的促增殖生长因子）处理的原代小鼠肝细胞中发现嗜酸性粒细胞趋化蛋白水平与增殖细胞核抗原（PCNA）一起迅速增加（图1E-F）。

图1 小鼠肝再生过程中，嗜酸性粒细胞趋化因子变化差异

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

2.BRG1敲除减少嗜酸性粒细胞的浸润

BRG1在肝再生过程中的作用在先前的研究中已有报道，为探讨BRG1与嗜酸性粒细胞之间的作用，研究者检测了野生型（WT）及BRG1肝脏条件性敲除（Brg1LKO（的上述两种小鼠模型的嗜酸性粒细胞在肝脏的浸润情况，结果显示Brg1LKO的嗜酸性粒细胞的浸润程度明显下降（图2A）。Brg1LKO小鼠肝脏中几种嗜酸性粒细胞特异性细胞因子的水平普遍下调，包括白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13（图2B, C）。在APAP模型中也有类似的观察结果（图2D-F），因此研究者得出结论，肝细胞中BRG1缺陷可能会干扰肝再生过程中嗜酸性粒细胞的渗透。为了进一步验证这一结论，研究者将WT小鼠和Brg1LKO小鼠中分离出原代肝细胞，并用HGF处理。从暴露于HGF处理的WT肝细胞收集的条件培养液比从Brg1LKO肝细胞收集的条件培养液诱导更强的嗜酸性粒细胞迁移（图2G）。

图2 小鼠肝再生过程中，嗜酸性粒细胞趋化因子变化差异

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

3. BRG1缺陷下调体内和体外嗜酸粒细胞趋化因子的表达

因为BRG1缺陷与肝脏再生过程中嗜酸性粒细胞在肝脏中浸润减少有关，所以研究者研究了BRG1可能有助于诱导嗜酸性粒细胞表达的可能性。经qPCR及ELISA检测，与2/3 PHX后的WT肝相比，Brg1LKO肝中eoaxin mRNA和eoaxin蛋白的表达分别下调了58%和61%（图3A，B）。同样，与WT肝脏相比，注射APAP后，Brg1LKO肝脏中eoaxin mRNA的表达下降了70%（图3C），eoaxin蛋白水平下降了62%（图3D）。同样，当从Brg1LKO肝脏分离出原代肝细胞并用HGF处理时，eoaxin的诱导表达没有从WT肝脏分离的细胞那么强（图3E, F）。更重要的是，在从Brg1LKO肝细胞收集的条件培养液中添加重组eoaxin（mrEoaxin）纠正了促进嗜酸性粒细胞浸润的不足（图3G）。

图3 BRG1敲除后嗜酸性粒细胞趋化蛋白表达的差异

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

4. BRG1直接与嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子结合并激活嗜酸性粒细胞趋化因子转录

为了研究BRG1是否直接在转录层面影响嗜酸性粒细胞趋化因子的表达，研究者进行了细胞转染实验，结果显示BRG1过表达与肝细胞生长因子处理联合作用增强了两个较长的嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子结构（−1363和−300）的活性，但它未能激活最短的（−50）结构，这表明BRG1可能相对于转录起始点与−300和−50之间的嗜酸性粒细胞趋化因子启动子结合（图4A），进一步的染色质免疫沉淀（ChIP）实验研究者分为两组进行：第一组(#1，−101/+115）位于嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子近端区域，含有一个保守的NF-κB s；第二组（#2，−1429/−1154）位于嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子远端，含有转录因子C/EBP、SMAD和AP-1的基序。结果显示，在2/3PHX（图4B）或APAP注射（图4C）后的再生肝脏中，BRG1开始占据近端的eoaxin启动子（由引物组#1扩增），但不占据远端的嗜酸性粒细胞趋化因子启动子（由引物组#2扩增），其动力学反映了嗜酸性粒细胞趋化因子的诱导表达。在原代小鼠肝细胞中，HGF处理类似地刺激BRG1向近端嗜酸粒细胞趋化因子启动子募集，在处理后早期（24小时）达到顶峰，并在随后的时间点消退（图4D）。

图4 BRG1直接与嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子结合

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

5.Brg1与NF-κB相互作用激活嗜酸性粒细胞趋化蛋白转录

在嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子上，在κ300和−50之间有一个保守的NF-κB位点[21]。Re-ChIP分析表明，在经肝细胞生长因子（图5A）处理的肝细胞中，可以在Eoaxin启动子的近端检测到BRG1-NF-κB/p65复合体，这表明NF-κB可能是BRG1Eoaxin募集和Eoaxin诱导所必需的。通过NF-κB的磷酸化检测证明，肝细胞生长因子处理刺激了NF-κB的活性，被siRNA介导的NF-κB耗竭（图5B）及EVP4593降低NF-κB的磷酸化[22]（图5F），减弱了嗜酸性粒细胞趋化蛋白的诱导，NF-κB的磷酸化降低也减弱了BRG1与嗜酸性粒细胞趋化蛋白启动子的结合（图5C, D, G-I）。

图5 BRG1与NF-κB的相互作用

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

6.嗜酸性粒细胞趋化因子对小鼠肝再生的影响

为了进一步明确Eoaxin在体内与肝再生的相关性，研究者对WT及Brg1LKO小鼠行尾静脉注射携带嗜酸性粒细胞趋化蛋白表达载体（Ad-eoaxin）或对照载体（Ad-GFP）的腺病毒后行PHx（图6A），qPCR（图6B）和ELISA法（图6C）的结果显示，腺病毒介导的Eoaxin的过度表达弥补了Brg1LKO肝脏中eoaxin的不足，补充嗜酸粒细胞趋化因子部分恢复了肝再生（图6D）。在注射Ad-GFP的Brg1LKO小鼠中，促增殖基因Ccna2、Ccnb1、Ccnd1和Myc的表达水平明显降低，而在注射Ad-eoaxin的Brg1LKO小鼠中显著升高，同样在注射Eoaxin的Brg1LKO肝脏中，嗜酸性粒细胞衍生的促再生细胞因子（IL4、IL5和IL10）的水平与WT肝脏没有区别（图6E）。Ki67染色发现，嗜酸性粒细胞趋化蛋白的过度表达同样促进了Brg1LKO小鼠的肝再生（图6F）

图6 嗜酸性粒细胞趋化因子在体内与肝再生的相关性

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

7.人肝标本中BRG1/eoaxin表达与嗜酸性粒细胞浸润的关系

为了确定BRG1介导的嗜酸性粒细胞转录是否可能参与人类肝脏中的嗜酸性粒细胞浸润，研究者对急性肝功能衰竭患者的标本进行了免疫组织化学染色。结果显示，在BRG1高表达的地方有明显的强嗜酸性粒细胞染色，并检测到强健的嗜酸性粒细胞浸润（图7A）。线性回归分析证实，BRG1/eoaxin的表达与人肝脏中嗜酸粒细胞的浸润显著相关（图7B）。

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图7 人肝标本中BRG1/eoaxin表达与嗜酸性粒细胞浸润的关系

（图源：Z. Fan,et al., Cell Death Dis, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，嗜酸性粒细胞的浸润与肝再生有关并有助于肝再生。文章研究发现，与静止肝脏相比，增殖小鼠肝脏中eotaxin-1的表达升高。当原代鼠肝细胞暴露于肝细胞生长因子（HGF），可以刺激嗜酸性粒细胞趋化因子的表达。Brg1的肝脏特异性缺失可减弱小鼠嗜酸性粒细胞浸润和下调嗜酸性粒细胞趋化因子的表达，同时也阻断了培养的肝细胞中HGF诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子的表达。进一步分析表明，Brg1可以直接与近端嗜酸性粒细胞趋化因子启动子结合以激活其转录。机制上，Brg1与NF-κB相互作用以激活eotaxin转录，NF-κB抑制破坏了Brg1向eotaxin启动子的募集，并阻止了肝细胞中eotaxin的诱导。eotaxin的过表达可以克服Brg1缺乏导致的肝脏再生延迟。相反，eotaxin耗竭会延缓肝脏再生。

总之，此项研究揭示了Brg1通过调控嗜酸性粒细胞的转运与肝再生的相关性。值得注意的是，如果补充嗜酸性粒细胞功能相关的介质，例如IL-4，是否可以挽救嗜酸性粒细胞缺乏症？因为已经有研究证明补充嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞衍生物质可在许多疾病模型中提供保护。在以后的研究中将继续解决这些问题对于在肝衰竭的治疗非常重要。

原文链接：Trans-activation of eotaxin-1 by Brg1 contributes to liver regeneration - PubMed (nih.gov)

邹晓平（左）陆云杰（右）

（照片提供自：邹晓平/陆云杰团队）

作者简介（上下滑动阅读）  

邹晓平，医学博士，主任医师，教授，博士生导师，江苏省创新团队领军人才，享受国务院政府特殊津贴。SCI收录论文90余篇。承担国家自然科学基金7项，省级科研基金6项，市级科研基金6项，共获得经费1500万元。出版专著《上消化道超声内镜临床应用》等4部，参编著作10余部。荣获国家科技进步二等奖、中华医学科技奖二等奖、上海市科技进步一等奖、军队医疗成果二等奖、江苏医学科技奖一等奖、江苏省科学技术奖二等奖、江苏省医学新技术引进奖一等奖、中国医师协会第六届中国医师奖、江苏省有突出贡献中青年专家、南京市十大科技之星等荣誉称号。

陆云杰，医学博士，主治医师，博士后，硕士生导师，美国明尼苏达大学及德国弗莱堡大学访问学者。长期从事肝脏疾病的临床及基础研究。目前共发表论文40余篇，担任 “江苏省免疫学会青年委员”，“江苏省研究型医院学会——肝胆疾病精准治疗专业委员会青年委员”。承担国家自然科学基金1项，省级科研基金3项，市级科研基金2项。荣获“中国优秀博士研究生代表”称号，德国DAAD奖学金，江苏省医学青年科技奖等。

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本文完