STTT︱朱依谆团队揭示类风湿关节炎发病新机制

撰文︱王   冉

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的慢性自身免疫性疾病，会导致关节进行性破坏，严重损害身体机能和生活质量[1]。若不进行及时且合理的药物干预，80%的患者在患病3年后将无法活动[2]。在RA的发病机制中，活化的滑膜成纤维细胞样细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）可通过自身增殖、迁移和侵袭参与RA炎症的发展过程[3]。尽管现代研究已对RA进行了一定程度的探索，但我们对RA发病机制的认识仍存在很多值得进一步研究的空间。因此，深入发掘 RA 的发病机制具有重要的科学价值和临床意义。

Neuron Navigator 2（NAV2）属于Neuron Navigator家族，主要调节神经系统中神经元的生长、迁移和再生，在脑、肾、肝中高度表达，也存在于骨骼、心脏中[4]。早期研究发现 NAV2可促进皮肤黑色素瘤细胞的侵袭并且在黑色素瘤患者的不良预后中起至关重要的作用[5]。此外，在蛋白质组学的结果中，与健康志愿者相比，RA患者滑膜组织原代滑膜成纤维细胞中NAV2异常表达[6]。然而，NAV2在RA中的具体作用仍然未知。

2022年7月8日，澳门科技大学药学院朱依谆讲座教授（也是复旦大学特聘讲座教授）带领博士研究生王冉联合上海中医药大学风湿科茅建春主任、北京航天中心医院药剂科刘桦主任在Signal Transduction and Targeted Therapy（STTT）上发表了题为“STAT3-NAV2 axis as a new therapeutic target for rheumatoid arthritis via activating SSH1L/Cofilin-1 signaling pathway”的原创研究结果。该研究通过临床样本、超级增强子测序、基础实验联合分析首次发现了STAT3-NAV2轴在类风湿关节炎中发挥重要作用，抑制RA FLS中NAV2的表达可以通过调控SSH1L/Cofilin-1信号通路逆转炎症相关表型，并阻止RA的进展，提示NAV2及其调控因子STAT3在多种自身免疫性疾病可能发挥潜在作用。

研究者首先进行RA FLS 超级增强子测序实验。RA FLS中的超级增强子（super-enhancer，SE）识别是通过 ChIP-seq 针对 H3K27ac 修饰进行的。超级增强子是指长度为8-20 kb的超长顺式作用元件，具有转录增强活性，可高密度组装关键转录因子和辅因子并激活干细胞中身份决定基因的表达。因此，SE在决定细胞转录中起重要作用。研究结果显示，人RA FLS（CHIPMD）中H3K27ac的ChIP-seq 信号显著增加。H3K27ac在编码基因区的富集水平显示SE整体水平在 RA FLS 中显著增加。此外，研究者还发现在人RA FLS中，SE的信号强度明显强于普通增强子。共1368个SE相关基因在 RA FLS中被鉴定，这表明在RA中有更多的致病基因被驱动表达以促进疾病进展。GO分析和KEGG通路分析确定了RA与SE相关的靶点和通路。这些结果表明，SE相关基因和信号通路在RA FLS中异常活跃，可能促进RA的进展。更有趣的是，NAV2的SE信号显示在人RA FLS中显著升高（图1）。

图1 类风湿关节炎病人滑膜成纤维细胞超级增强子测序

（图源：Ran Wang et al., STTT, 2022）

为了探究NAV2在类风湿关节炎中具体机制，研究者采用小干扰RNA的实验方法沉默NAV2表达，使用Western Blot、免疫双荧光染色和RT-qPCR的实验方法，检测相关炎症蛋白表达和SSH1L/Cofilin-1信号通路。研究发现当NAV2表达降低后，炎症蛋白IL-6、iNOS、MMP-3和MMP-9表达水平显著下降，且SSH1L/Cofilin-1信号通路受到抑制（图2）。

图2 沉默NAV2后相关炎症蛋白以及SSH1L/Cofilin-1信号通路的变化

（图源：Ran Wang et al., STTT, 2022）

此外，研究者还发现使用小干扰RNA敲低NAV2的表达后，滑膜成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移也受到显著抑制（图3）。

图3 沉默NAV2后类风湿关节炎相关表型受到抑制

（图源：Ran Wang et al., STTT, 2022）

最后，作者对NAV2加速类风湿关节炎炎症反应和相关表型的潜在机制进行深度挖掘。研究者发现TNF-α在RA FLS中时间依赖性地显著增加STAT3磷酸化（p-STAT3）。然后，在FLS中过表达STAT3导致NAV2表达上调，而STAT3的敲低具有相反的效果。为了进一步阐明STAT3可调节NAV2的表达，进而促进RA炎症反应，作者进行了荧光素酶报告基因测定和ChIP-qPCR实验检测。实验结果显示，STAT3表达升高可以显著增强NAV2的转录活性， STAT3可以结合在NAV2基因上游的启动子区域（图4）。

图4 转录因子STAT3调控NAV2表达

（图源：Ran Wang et al., STTT, 2022）

根据分子结合模式，可以清楚地看到NAV2蛋白和STAT3蛋白很好结合（结合能为-65.05 kcal/mol）。这些氢键可以有效地将两种蛋白质紧密结合形成稳定的复合物。 RMSD可测量原子之间的平均距离，以揭示模拟过程中随时间推移的结构变化。RMSD值的偏差越小意味着稳定性越好。STAT3-NAV2复合物的RMSD值明显降低并保持在0.4 nm左右，表明具有优越的相互作用效率和稳定性。总的来说，分子对接和分子动力学模拟都表明转录因子STAT3可以与NAV2紧密结合进而发挥作用（图5）。

图5  STAT3和NAV2分子对接分析

（图源：Ran Wang et al., STTT, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，研究者提供了令人信服的证据，证实NAV2是RA FLS在增殖、迁移和侵袭中的一种新调节因子。该研究首次表明，抑制RA FLS中NAV2的表达可以通过调节SSH1L/Cofilin-1信号通路逆转炎症相关表型并阻止RA进程，提示NAV2及其转录因子STAT3在多种疾病中的潜在作用。由于慢性疼痛是RA的主要特征，研究者还推测，靶向STAT3-NAV2轴可能会干扰支配 RA 疼痛关节神经元的敏感性。因此，STAT3-NAV2轴作为一个潜在的分子靶点，为抑制炎症性疾病（如RA），提供了一个极具吸引力的新方向，该方向也是研究者后续进行科研实验和临床转化的重要目标。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-022-01050-7.pdf

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[1] Sparks, J.A., Rheumatoid Arthritis. Ann Intern Med, 2019. 170(1): p. ITC1-ITC16.

[2] Aletaha, D. and J.S. Smolen, Diagnosis and Management of Rheumatoid Arthritis: A Review. JAMA, 2018. 320(13): p. 1360-1372.

[3] Bartok, B. and G.S. Firestein, Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunological reviews, 2010. 233(1): p. 233-255.

[4] Maes, T., A. Barceló, and C. Buesa, Neuron navigator: a human gene family with homology to unc-53, a cell guidance gene from Caenorhabditis elegans. Genomics, 2002. 80(1): p. 21-30.

[5] Hu, W., et al., NAV2 facilitates invasion of cutaneous melanoma cells by targeting SNAI2 through the GSK-3β/β-catenin pathway. Archives of dermatological research, 2019. 311(5): p. 399-410.

[6] Wang, J.G., et al., Disorders in angiogenesis and redox pathways are main factors contributing to the progression of rheumatoid arthritis: a comparative proteomics study. Arthritis Rheum, 2012. 64(4): p. 993-1004.

本文完