Nat Commun︱德国马普心肺所袁学军团队发现S期异常转录可影响DNA复制并致癌

撰文︱张    婷，袁学军

责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

成体干细胞（ASCs）不仅是维持器官稳态和再生所需，也是肿瘤的来源之一[1]。在持续再生过程中由于ASCs失去静止状态, 致癌基因的激活或其他原因导致基因组不稳定，从而促进癌症的发生[2,3]。DNA修复基因的突变在非遗传性癌症中并不常见，因此DNA复制压力（Replication Stress）即复制叉的减慢或停滞极可能是基因组不稳定的元凶[4]。已知诸多原癌基因如Ras、Myc、Cdc25A或cyclin E等的过量表达会造成复制压力。最近的研究发现这很大一部分归因于DNA转录和复制之间的相撞（transcription replication collisions，TRCs）[5]。在细胞周期的S期，从事DNA复制的分子机器（复制体，replisome）与将DNA转录为mRNA的分子机器会随着各自的复制与转录进程，沿着同一DNA双链向前移动。已知这两个机器之间的正面相撞会导致了DNA复制叉的停滞和RNA：DNA杂交体（R环）的积累[6,7]。停滞的DNA复制叉断裂后会在癌细胞中引起DNA双链断裂和染色体重排。进一步了解正常分裂的干细胞是如何精密调控这两个进程从而避免这种正面相撞，以及这种相撞是否可直接导致肿瘤的发生，对于肿瘤的预防和治疗具有重要的临床指导作用。

2022年11月14日，来自德国马克斯-普朗克心脏和肺研究所的袁学军（通讯作者），张婷（第一作者）团队在Nature Communications上发表了题为“Replication collisions induced by de-repressed S-phase transcription are connected with malignant transformation of adult stem cells ”的研究。该研究发现在肌肉干细胞（MuSCs）中缺乏组蛋白H4K20-二甲基转移酶KMT5B（也被称为SUV4-20H1），可以导致S期转录异常，从而诱发TRCs。这种细胞会在P53缺失时更快速发生癌变，形成横纹肌肉瘤。与正常组织相比KMT5B的低表达也存在于横纹肌肉瘤以外的其它人类肉瘤中，并与肿瘤复发有密切关系，表明KMT5B在抑制人类肉瘤形成中具有普遍功能。

在前期的研究中，同一团队的研究人员发现Kmt5b的失活会导致静止期的MuSCs的早熟激活[8]。进一步的研究发现Kmt5b的缺失引起MuSCs的增殖减缓，S期的DNA损伤以及DNA的复制压力增强。这种复制压力进一步导致有丝分裂异常，最终引起不稳定的染色体即非整倍体和含有微核的MuSCs的积累。

接下来，研究人员通过荧光染色发现敲除Kmt5b会造成H4K20me1在S期（EdU+）特定的积累。为了研究Kmt5b敲除导致的H4K20me1在S期的MuSCs的常染色质中的积累是否增强基因的转录和延伸，他们进行了CUT&RUN实验以检查H4K20me1和磷酸化的（CTD第2位丝氨酸）RNA聚合酶II（Pol II S2P）的全基因组分布。与以发表的研究数据一致，H4K20me1在编码基因体上的富集与Pol II S2P的富集程度呈正相关。重要的是敲除Kmt5b使得Pol II S2P在基因体中的富集增强，表明Kmt5b敲除提高了基因转录延伸的活跃程度。为了研究转录活性的增强是否主要局限于S期，研究人员在培养的MuSCs中结合PCNA免疫染色进行了5-乙炔基尿苷（5-EU）的融合试验。他们发现与对照细胞相比EU信号在Kmt5b敲除的非S期（PCNA-）细胞中保持不变，而在S期（PCNA+）Kmt5b敲除的MuSCs中明显增强，表明Kmt5b敲除的MuSCs中，转录活性特别在S期得到增加。总的来说，结果表明KMT5B介导的从H4K20me1到H4K20me2的转化对S期的转录抑制至关重要。

S期基因活动异常增加产生的转录机器可能遇到复制叉，导致TRCs和不受控制的R环的积累。为了证明TRCs的发生，研究人员用PCNA和Pol II S2P抗体进行了近距离连接试验（Proximity Ligation Assay），以检测是否复制体和转录机器在S期（EdU+）存在共同定位。在Kmt5b失活后，含有三个以上PCNA-Pol II S2P PLA灶点并处于S期的MuSCs的数量明显增加。值得注意的是，Kmt5b敲除的MuSCs中的PCNA-Pol II S2P PLA点主要存在于早期复制的常染色质内，而不是中晚期复制的异染色质内（图1a, b）。这一发现表明，TRCs主要发生在S期前期转录活跃的常染色质内，并直到S期后期仍未被解决。同时，在S期的Kmt5b敲除的MuSCs只有在表达外源野生型而非不具有催化活性的变异的人源KMT5B才可将TRCs减少到几乎对照组水平，表明TRCs是由于H4K20me1向H4K20me2转化失败所致。为研究TRCs是否会导致复制叉停滞并促进形成破坏基因组稳定的R环，他们接下来用特异识别R环的S9.6抗体来进行DNA点阵印记实验（DNA dot blot）以检测基因组DNA中的R环的含量。结果表明Kmt5b的丢失促进了S期的MuSCs中R-环的形成（图1c）。DNA-RNA免疫沉淀测序(DRIP-seq)发现，敲除Kmt5b促使R-环聚集在同时有H4K20me1和Pol II S2P增加的基因上，表明转录激活的增强是Kmt5b敲除的MuSCs中R-环形成增加的主要原因。同时，R-环形成增加主要发生在与癌症发展有关的基因上，而其中一些基因，特别是与DNA损伤反应、细胞迁移和RAS信号相关的基因，如Akt3、Braf、Cdk6、Hmga2、Yap1、Wwtr1、Rasa1、Agap2和肿瘤抑制基因Nf1、Foxo1、Rb1、Arid4b和Robo1，在人类横纹肌肉瘤中经常发生改变。总之，这些研究结果表明，KMT5B介导的S期基因体上H4K20me1向H4K20me2的转化可以防止复制-转录冲突。

图1 Kmt5b的缺失导致转录复制冲突和R-环积累。

（图源：Zhang et al., Nat Commun, 2022）

为了验证在S期转录活性的增强促进了Kmt5b敲除的 MuSCs中TRCs和R环的形成，研究人员用低剂量（10µM）的5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-ribofuranoside（DRB）处理对照组和Kmt5b敲除的 MuSCs，以削弱转录的活性。低剂量DRB处理不仅减少了Kmt5b敲除的 MuSCs 转录延长特异性Pol II 的蛋白水平，同时把在S期 Kmt5b敲除的 MuSCs中增强的EU结合率降低到了与对照组 MuSCs相似的水平而不明显干扰非S期的转录。因此，低剂量DRB处理对S期 Kmt5b敲除的 MuSCs转录的选择性作用是由于S期染色质紧实度降低引起的。延伸的衰减降低了S期（EdU+）突变体MuSC的γH2AX水平，表明DNA损伤减少。此外，DRB处理使S期 Kmt5b敲除的 MuSCs中增加的TRCs恢复到对照组水平，并减少了由S9.6抗体检测到的异常R环积累。

Kmt5b的缺失激起了MuSCs中各种致癌基因的复制压力并促进了R环的形成，从而激活了促肿瘤信号，但这并不直接导致MuSC恶性转化。研究人员发现Kmt5b敲除的 MuSCs中P53通路的明显上调，以此推测P53通路的激活诱导了细胞周期停滞和衰老，从而产生一个肿瘤转化的障碍。为了证明这一假设，他们在Kmt5b敲除的 MuSCs中同时敲除了p53基因。p53的缺失改善了Kmt5b敲除的 MuSCs的衰老表型。Kmt5b/p53 双敲除的 MuSCs不仅绕过了细胞周期停滞，而且比对照和p53敲除的 MuSCs增殖更快。p53的失活更加剧了Kmt5b敲除的 MuSCs的基因组不稳定性，表现为γH2AX水平的增加、异常有丝分裂的加剧、以及更多的非整倍体和微核的形成，证实了p53消除潜在危险细胞的关键功能。研究结果进一步显示所有Kmt5b/p53 双敲除的小鼠在诱导P53缺失后30周内，在附属物或躯干的肌肉组织内或非常接近的地方迅速形成软组织肌肉瘤（图2）。总之，Kmt5b敲除的 MuSCs中p53的丢失加剧了基因组的不稳定性，并阻止了对细胞增殖的抑制，导致MuSC的癌性转化，最终导致横纹肌肉瘤的形成。

图2 缺失Kmt5b促使p53 敲除小鼠快速产生软组织肌肉瘤。

（图源：Zhang et al., Nat Commun, 2022）

为了研究KMT5B是否在人类肉瘤的形成中起普遍作用，研究人员分析了TCGA泛癌数据库。他们发现KMT5B在肉瘤中的表达明显低于其他大多数恶性肿瘤。在29种癌症类型中，KMT5B的低表达与较短的无病间隔期有正相关系，这表明KMT5B在人类肉瘤进展和复发中起重要作用。KMT5B在肉瘤中的低表达可能是由于11号染色体q13的结构异常造成的，其中27.4%肉瘤样本显示KMT5B拷贝确失。此外，KMT5B的启动子区域甲基化程度更高，可能是KMT5B转录抑制的另一原因。

图3 Kmt5b防止S期转录复制碰撞，从而保护基因组稳定的机制模型

（图源：Zhang et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者证明了一个将H4K20me1转化为H4K20me2的表观遗传修饰因子KMT5B通过抑制S期转录来防止干细胞发生癌变。这为进一步理解细胞如何协调转录和复制提供新思路，为转录复制冲突促进癌症的发生提供了新的体内研究证据（图3）。KMT5B低表达的肉瘤患者的无病间隔期较短，这表明KMT5B水平可能是一个有用的预后标志，而调控S期的转录水平可能成为今后肿瘤治疗的潜在靶点。TRCs可以在在整个肿瘤发展过程中持续存在，但却不会阻碍肿瘤的生长，说明肿瘤细胞可能建立了解决TRCs的有效途径，以演化成快速增殖的细胞，如通过RNAP跳过、重修、驱逐和降解等手段。进一步了解肿瘤细胞内TRCs的解决途径有助于寻找肿瘤治疗的新靶点。

原文链接：https://rdcu.be/c0pwB

德国马普心肺所所长Thomas Braun教授，Principal Investigator袁学军博士是论文的共同通讯作者，博士后张婷是论文的第一作者。该研究得到德国科学基金会和联邦州卓越计划的资助。

通讯作者：袁学军（左）；第一作者：张婷（右）

（照片提供自：袁学军团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

袁学军，德国海德堡大学/癌症研究中心博士。现任德国马克斯普朗克心肺研究所课题组组长，德国心血管研究中心（DZHK）成员，Front.Cardiovasc. Med., Sec. Pediatric Cardiology 的客座编委等。作为Principal investigator, 主持了德国国家SFB， TRR 基金以及泛大西洋心血管疾病研究基金（Leducq）等项目，引领团队对有关调节心脏，肺，骨骼肌等组织的发育，再生与疾病的表观遗传机制研究进行了深入的研究。

近年来, 袁学军博士领导课题小组完成了多项表观遗传学相关课题并以共同通讯作者在Journal of Clinical Investigation, Circulation, Nature Communication, Nature Genetics等高水平学术刊物上发表论文。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1]Batlle, E. & Clevers, H. Cancer stem cells revisited。Nat Med 23, 1124-1134 (2017).

[2]Aguilera, A. & Garcia-Muse, T. Causes of genome instability.Annu Rev Genet 47, 1-32 (2013).

[3]Negrini, S., Gorgoulis, V.G. & Halazonetis, T.D. Genomic instability an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 220-8 (2010)

[4]Zeman, M.K. & Cimprich, K.A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol 16, 2-(2014).

[5]Kotsantis, P., Petermann, E. & Boulton, S.J. Mechanisms of Oncogene-Induced Replication Stress: Jigsaw Falling into Place. Cancer Discov 8, 537-555 (2018).

[6]Macheret, M. & Halazonetis, T.D. Intragenic origins due to short G1 phases underlie oncogene-induced DNA replication stress. Nature 555, 112-116 (2018).

[7]Jones, R.M. et al. Increased replication initiation and conflicts with transcription underlie Cyclin E-induced replication stress. Oncogene 32, 3744-53 (2013).

[8]Voonsanay V, et al. Regulation of Skeletal Muscle Stem Cell Quiescence by Suv4-20h1-Dependent Facultative Heterochromatin Formation. Cell Stem Cell,18, 229-42 (2016)

本文完