STAR Protocols︱Ioannis Nezis/张艳课题组报道果蝇头的非标定量蛋白质组学方法
撰文︱张 艳
责编︱王思珍，方以一
编辑︱杨彬薇细胞自噬是维持细胞稳态所必需的。细胞自噬可以分为非选择性自噬和选择性自噬。在选择性自噬中，Atg8起着至关重要的作用，它可以通过LDS（LIR docking site）与含有LIR 基序的选择性自噬受体相互作用，从而将降解底物定向运送到自噬体中降解。越来越多的研究表明，选择性自噬功能异常与许多人类重大疾病相关，如帕金森症、亨廷顿症、阿尔兹海默症等神经退行性疾病，癌症，细菌和病毒感染病等[1-3]。因此，研究选择性自噬发生的分子机制将为相关疾病的治疗提供新的理论依据，而果蝇作为经典的模式生物被广泛应用于选择性自噬和疾病研究领域。
2022年11月11日，华威大学生命科学学院Ioannis Nezis课题组和西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心张艳课题组在Cell子刊STAR Protocols杂志在线发表了题为“Label-free quantitative proteomic analysis of adult Drosophila heads”的实验方案文章（Protocol）。该文章展示了果蝇非标定量蛋白质组学研究的实验和分析流程。
Ioannis Nezis课题组一直致力于选择性自噬的分子机制研究。为了研究果蝇Atg8a的LDS结构域在体内的生理功能，Ioannis Nezis课题组利用基因编辑技术获得了定点突变LDS的果蝇Atg8a LDS突变体。研究发现在Atg8a LDS突变体中，降解底物会大量富集。该研究利用非标定量蛋白质组学的方法比较分析了Atg8a 突变体和野生型果蝇头中的差异蛋白，筛选出了潜在的选择性自噬受体，为阐明选择性自噬的分子机制奠定了基础。
在这篇文章中，研究者详细阐述了利用非标定量蛋白质组学方法对野生型果蝇、Atg8a 突变体、Atg8a LDS突变体的头部蛋白质进行比较分析的实验方案（图1）。包括果蝇头部样品的采集、头部蛋白质提取、超滤管内酶解、质谱上机以及质谱数据分析等。
图1 非标定量蛋白质组学方案流程图
（图源：Zhang Y, Nezis IP., STAR Protoc, 2022）
在实验过程中如何减少样本间批次效应，提高数据的重复性是一个重要的问题。研究者收集了孵化1-2天的果蝇，饲养2星期后，只选取未交配的雄性果蝇作为实验材料。作者将几次实验重复样品在同一时间进行酶解前处理，然后进行质谱检测，这些大大地减少了样品间的误差，提高了样品间的重复性。通过分析，作者筛选到29个在Atg8a、Atg8a LDS突变体中都上调的蛋白质。作者利用课题组之前开发的iLIR motif预测网站（https://ilir.warwick.ac.uk/）[4]，对29个靶标蛋白质进行分析，发现有四个蛋白质有潜在的LIR motif，可能为选择性自噬受体。作者在本年度发表的一篇Cell Reports文章中[5]，对其中的高尔基体蛋白Gmap进行了深入的功能研究，发现Gmap可以直接与Atg8a结合，参与调节高尔基体自噬并影响高尔基体的形态。
综上所述，在这项工作中，研究者系统地描述了非标定量蛋白质组学的实验流程和分析方法（图1），详细阐述了利用非标定量蛋白质组学筛选果蝇选择性自噬受体的步骤和方法。该研究方案还提供了实验过程中可能出现的问题的解决方案，可以作为后续相关研究提供重要参考。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666166722007109
西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心的张艳副教授为该工作的第一作者和共同通讯作者，英国华威大学的Ioannis Nezis教授为该工作的最后通讯作者。张艳副教授主要从事昆虫营养与生长发育研究，已在Cell reports、Autophagy、STAR Protocols、Insect Biochem Mol Biol等杂志发表SCI文章40余篇。
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本文完