Nat Commun | 林建平/连佳长团队合作发表重构酿酒酵母代谢途径实现24-表-麦角甾醇的高效合成
撰文︱蒋亦琪，林建平，连佳长责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇
油菜素内酯类化合物（Brassinosteroids，BRs），被认为是第六类植物激素，参与调节许多重要的植物生理活动，在提高作物的产量、品质、抗逆性（对外界不利环境的抵抗能力，如耐寒、耐盐、耐旱等）和抗病性等方面效果显著[1]。在BRs中，油菜素内酯（Brassinolide，BL）是最早发现的天然油菜素内酯类化合物，也是其中活性最高的化合物[2]。然而，由于BL在植物中含量很低，即便是在花粉中的含量也大多低于百万分之一[3]，从中提取获得的BL价比黄金。此外，由于缺少可以规模供应的前体物质或者成本太高，各种化学合成生产BL的技术，经过全球科学家多年的努力，仍未能商业化应用。最终，产业界只能退而求其次，将其两种生物活性尚可的结构类似物（24-表-油菜素内酯和28-高-油菜素内酯）规模生产并应用于农业[4]。因此，提供可以规模化制备的前体物质，借助成熟的从麦角甾醇合成24-表-油菜素内酯的工艺合成BL，具有重要的经济与农业生产意义。
2023年1月27日，浙江大学化学工程与生物工程学院林建平教授和连佳长研究员课题组合作在Nature Communications发表了题为“Manipulation of sterol homeostasis for the production of 24-epi-ergosterol in industrial yeast”的研究。本研究在酿酒酵母中构建了一条人工设计的合成途径，实现了非天然甾醇——24-表-麦角甾醇（24-epi-ergosterol）的从头合成，同时，采用蛋白质工程以及甾醇稳态工程，提高24-表-麦角甾醇的产量，通过高密度发酵，实现了2.76 g·L-1 24-表-麦角甾醇的从头生物合成，为以接近24-表-油菜素内酯的价格向市场提供天然油菜素内酯奠定了基础。
图 1 从头合成24-表-麦角甾醇酿酒酵母菌株的构建
（图源：Jiang YQ , et al., Nat Commun, 2023）
24-表-麦角甾醇，作为一种非天然甾醇，目前还没有以24(28)-去氢麦角甾醇（ergosta-5,7,22,24(28)-tetraene-3β-ol）为底物进行生物合成的相关报道，因此，设计人工生物合成途径成为可能的最佳选择（图1）。研究者以手性催化的偏好性（甾醇Δ24(28)的还原）和底物结构的相似性（甾醇侧链）作为主要筛选标准，对植物甾醇生物合成途径的数据库进行了探索。通过比较酵母和植物中的甾醇生物合成途径，研究者选择了植物来源的Δ24(28)-甾醇还原酶（Dimunito/Dwarf1，DWF1），一种分别催化C28-和C29- Δ24(28)-烯烃甾醇形成24-甲基和24-乙基胆甾醇的还原酶，用于构建24-表-麦角甾醇的人工合成途径（图2a）。研究团队在敲除酵母天然的编码Δ24(28)还原酶的ERG4的基础上，分别尝试引入不同来源的DWF1，成功实现24-表-麦角甾醇人工途径的构建（图2b-d）。
图 2 24-表-麦角甾醇合成途径的构建
（图源：Jiang YQ , et al., Nat Commun, 2023）
在初步验证24-表-麦角甾醇人工途径构建的可行性后，研究者尝试通过蛋白质工程提高DWF1的催化能力。由于缺乏DWF1及其同源酶的晶体结构，定向进化提高DWF1催化活性成为首选，这就需要一个较为高效的高通量筛选方法。据报道，erg4Δ酵母菌株（缺乏麦角甾醇）表现出表型缺陷，如对十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）和潮霉素B（Hygromycin B，HygB）的敏感增强。考虑到结构的相似性，24-表-麦角甾醇可能会在一定程度上回补麦角甾醇的缺失，从而恢复表型缺陷。基于此，研究者尝试利用DWF1活性与SDS和HygB胁迫条件下的细胞生长存在的可能联系来构建高通量筛选方法。为了验证高通量筛选方法的可行性，研究者构建并比较了四株酵母菌株（产不同水平的麦角甾醇/24-表-麦角甾醇）在添加100 μg·mL-1 HygB以及不同浓度SDS的YPD培养基中的生长情况。如图3a所示，在同等的SDS和HygB胁迫条件下，DWF1活性（24-表-麦角甾醇含量）与细胞生长之间存在一定程度的正相关；同时，根据实验结果，选择添加0.025% SDS和100 μg·mL-1 HygB的YPD培养基作为高通量筛选培养基。通过易错PCR构建突变文库，结合高通量筛选，研究者获得了六个阳性突变体（图3b），测序获知了10个单点突变；通过定点突变，对10个单点突变体进行活性验证（图3c）；通过对单点突变进行组合并高通量筛选，获得了28个阳性组合突变体，其中，具有V143G、S306P和Y338H组合突变的突变体Ar207在维持极佳的立体选择性的基础上，展现出更高的ArDWF1活性和24-表-麦角甾醇产量（图3d）。
图3 蛋白质工程提高DWF1催化能力
（图源：Jiang YQ , et al., Nat Commun, 2023）
脂滴（Lipid Droplets，LDs）和细胞膜之间的甾醇稳态主要由两种甾醇酰基转移酶（ARE1和ARE2）和三种甾醇酯水解酶（YEH1、YEH2和TGL1）调节（图4a）。为了评估它们在甾醇代谢中起到的作用，研究者对五个基因分别进行了敲除或过表达操作。如图4b所示，尽管敲除ARE1或过表达ARE2、YEH1和YEH2都有利于24-表-麦角甾醇的生物合成，但单基因操作的优化效果相当有限，可能需要通过同时对甾醇酰基化（储存游离甾醇于LDs）和甾醇酯水解（释放LDs中的甾醇酯至细胞膜中）进行调控，重建甾醇稳态。正如预期，研究者观察到了同时过表达酰基转移酶基因（ARE2）和水解酶基因（YEH1和/或YEH2）所产生的协同效应，在YPD培养基中，菌株YQE717（过表达ARE2、YEH1和YEH2）能够合成71.04 mg·L-1 24-表-麦角甾醇以及220.07 mg·L-1总晚期甾醇（具备Δ5,7的甾醇），比YQE231分别高1.65倍和2.09倍（图4b）。尽管ARE1失活菌株（YQE722）在摇瓶中的24-表-麦角甾醇产量较高，但在高密度发酵过程中，特别是在乙醇补料阶段，ARE1的敲除对菌体生长以及产物积累产生了负面效果（图4c），发酵120 h后，YQE717的细胞密度达到186.05 gDCW·L-1 （g干细胞重量每升），而YQE722仅为153.36 gDCW·L-1。因此，受到细胞量的影响，YQE717发酵产24-表-麦角甾醇的效价更高，达到了2.15 g·L-1。此外，在前36 h，二者的24-表-麦角甾醇和总晚期甾醇的产量相当。36 h后， YQE231中的甾醇生物合成几乎停止，而YQE717继续积累总晚期甾醇和24-表-麦角甾醇。为验证甾醇酰基化-水解平衡与甾醇积累之间的关系，研究者分别测定了YQE231和YQE717中ARE2、YEH1和YEH2的相对转录水平，结果表明，产物的积累与ARE2、YEH1和YEH2的基因表达量表现出一致的趋势。这些结果表明，24-表-麦角甾醇以及总晚期甾醇产量的增加归因于ARE2、YEH1和YEH2转录水平的提高，并由此带来的酵母中甾醇稳态的重建。
图4 甾醇酰基化-水解动态平衡调控
（图源：Jiang YQ, et al., Nat Commun, 2023）
尽管24-表-麦角甾醇的产量有了显著的提高，但24(28)-去氢麦角甾醇（DWF1的底物）以及其他前体甾醇也产生了明显的积累（图4b），这不仅降低了24-表-麦角甾醇的产量，而且增加了下游纯化的成本。为了实现更高比例24-表-麦角甾醇的合成，研究者通过替换ArDWF1突变体（Ar207）的启动子提高表达水平，同时过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的ACC1加强脂肪酸的生物合成，从而扩大24-表-麦角甾醇储存池，所得的菌株（YQE729）将24-表-麦角甾醇的产量增加到160.84 mg·L-1（图5a）。有趣的是，由PGAL1驱动的Ar207的表达导致了24-表-麦角甾醇生物合成途径中的另一种前体（24-表-麦角甾-5,7-二烯-3β-醇）的积累（图5a）。因此，研究者构建了过表达ERG5（编码Δ22甾醇去饱和酶）的重组菌YQE734，以进一步提升24-表-麦角甾醇在晚期甾醇的比例（图5a）。最后，研究者对YQE729和YQE734进行了高密度发酵测试，发酵结束时，YQE734的 24-表-麦角甾醇与晚期甾醇的比率高达84.2%（图5b）。总体而言，尽管YQE729和YQE734的24-表-麦角甾醇产量相近（约2.76 g·L-1），但目标产物在晚期甾醇中的高比例有利于降低下游的纯化成本（图5b），使得菌株YQE734更具工业应用前景。
图5 代谢途径工程提高24-表-麦角甾醇的产量和纯度
（图源：Jiang YQ , et al., Nat Commun, 2023）
综上所述，本研究在酿酒酵母中构建了一条人工设计的合成途径，实现了非天然甾醇——24-表-麦角甾醇的从头合成，同时，采用蛋白质工程以及甾醇稳态工程，提高24-表-麦角甾醇的产量，通过高密度发酵，实现了2.76 g·L-1 24-表-麦角甾醇的从头生物合成，为以接近24-表-油菜素内酯的价格向市场提供天然油菜素内酯奠定了基础。同时，本研究采用的甾醇平衡工程策略也有望应用于其他植物甾醇的生物合成，需后续研究进一步证明。此外，作为油菜素内酯类化合物（Brassinosteroids，BRs）生物合成途径前的一步关键限速酶，DWF1催化活性的提高，可能为在酵母中构建BRs生物合成途径奠定基础。
第一作者：蒋亦琪（左）；通讯作者：林建平（中），连佳长（右）
（图片提供自：林建平/连佳长团队）
第一作者
蒋亦琪，2017年本科毕业于浙江工业大学生物工程学院，2017年至今就读于浙江大学化学工程与生物工程学院攻读博士学位。
通讯作者
林建平，浙江大学教授、博士生导师，从事工业生物技术研究30余年。近年来主要研究方向包括应用合成生物学构建人工细胞工厂、工业生物催化剂的“定制”、生物质资源化技术等。曾担任863项目首席专家，主持863项目、国家自然科学基金项目、973项目和国家重点研发计划项目三级子课题、省部级项目和横向项目等共20余项。曾获省部二等奖2项、三等奖1项。参与出版教材和著作5部，获授权国家发明专利30余项，发表论文100余篇。
连佳长，生物质化工教育部重点实验室副主任，化学工程与生物工程学院研究员，博士生导师，入选国家级青年人才计划，浙江省杰出青年基金获得者。主要从事基于合成生物学原理和基因组编辑技术的人工细胞工厂创建研究。共发表论文60余篇，包括Nature Synthesis, Nature Communications, Metabolic Engineering, ACS Synthetic Biology,Biotechnology and Bioengineering, Chemical Engineering Journal, Bioresource Technology等。受邀担任Frontiers in Microbiology、BioDesign Research、BMC Biotechnology、《合成生物学》等期刊编委以及Nature Chemical Biology等期刊审稿人。
参考文献（上下滑动阅读）
[1] Peres, A. L. G. L. et al.Brassinosteroids, the Sixth Class of Phytohormones: A Molecular View from the Discovery to Hormonal Interactions in Plant Development and Stress Adaptation. International Journal of Molecular Sciences20 (2019).
[2] Liu, J. N. et al. Structure-activity relationship of brassinosteroids and their agricultural practical usages. Steroids 124, 1-17 (2017).
[3] Grove, M. D. et al. Brassinolide, a Plant Growth-Promoting Steroid Isolated from Brassica Napus Pollen. Nature281, 216-217 (1979).
[4] Baghel, M. et al. Pleiotropic influences of brassinosteroids on fruit crops: a review. Plant Growth Regulation 87, 375-388 (2019).