PLOS Pathog︱傅湘辉/田艳团队报道新冠防治潜在药物：拓扑替康和小檗胺靶向RG4，抑制新冠病毒感染
新型冠状病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）全球持续性大流行严重损害世界公共卫生安全和社会经济发展。针对新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2），目前已有多款疫苗及抗病毒药物上市，在疫情阻击战中发挥了重要作用。值得指出的是，新型冠状病毒基因组的突变和进化速度极快，容易产生免疫逃逸和药物耐受，可能影响现有疫苗和药物的有效性。因此，寻找更加广谱性的新冠病毒防治策略具有重要意义。
RNA-G四链体（RNA G-quadruplex，RG4）是由富含串联重复鸟嘌呤碱基（Guanine，G）核苷酸链组成的RNA高级结构，在哺乳动物和病毒基因组中广泛存在，可通过调控RNA剪切、转运和翻译等过程调节基因表达，参与疾病发生发展[1]。已有研究发现：SARS-CoV-2感染关键宿主因子TMPRSS2的RG4结构能够显著抑制其蛋白表达，阻碍SARS-CoV-2感染进程[2]；SARS-CoV-2基因组RNA也富含RG4结构，从而影响多个病毒结构和非结构蛋白的表达，调控病毒在宿主细胞体内的生物学进程[3]，提示RG4是广谱性抗新冠药物的潜在新靶点。截止目前，基于RG4的抗SARS-CoV-2临床药物尚无报道。
四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室的傅湘辉教授/田艳副研究员团队长期聚焦人类重大疾病致病新机制和新靶点发现，其前期研究揭示RG4抑制宿主因子TMPRSS2翻译及新型冠状病毒感染[2]。基于“病毒与宿主共靶向、多靶点”防治新冠感染的构想，该团队进一步拓展了RG4对其他宿主因子表达的调节作用，并筛选鉴定了新型RG4靶向药物，为COVID-19防治提供潜在临床用药，
近日在PLoS Pathogens上发表了题为“Targeting RNA G-quadruplex with repurposed drugs blocks SARS-CoV-2 entry”的研究。该研究发现RG4抑制ACE2、AXL、FURIN等宿主因子表达，并基于药物再利用策略，筛选获得了2个临床药物【拓扑替康（Topotecan，TPT）、小檗胺（Berbamine，BBM）】是RG4的新型稳定剂，可在细胞和动物水平阻碍SARS-CoV-2感染，为COVID-19防治提供了新的广谱性抗病毒策略。（拓展阅读：傅湘辉课题组相关研究进展，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：Nat Commun︱傅湘辉团队发现RG4有望成为新冠防治新靶点）
研究团队首先通过生物信息学对影响SARS-CoV-2感染的关键宿主因子进行RG4结构预测，发现ACE2、AXL、DPP4、FURIN、GOLGA7、ZDHHC5等mRNA宿主因子中均富含RG4位点（图1）；通过圆二色谱、荧光光谱等实验，证实其中ACE2、AXL、FURIN能够形成RG4结构（图1），结合团队此前在TMPRSS2中发现的RG4结构，提示了RG4在SARS-CoV-2宿主因子中广泛分布。
图1. RG4在SARS-CoV-2宿主因子中广泛分布
（图源：Qiyu Tong, et al., PLoS Pathog, 2023）
基于RG4在SARS-CoV-2基因组和关键宿主因子中普遍存在，以及RG4对基因表达的抑制作用，研究团队采用药物再利用策略，在G-四链体稳定剂化合物库中筛选出5个批准进入临床并且无严重心肺毒性的化合物。进一步通过计算机分子对接，获得2个能够与经典RG4结构结合的G-四链体稳定剂TPT和BBM（图2），并通过微量热涌动实验，在分子水平证实了TPT和BBM能够与宿主因子mRNA的RG4结构稳定结合（图2），提示TPT和BBM可能具有调控SARS-CoV-2宿主因子表达的作用。
图2. 药物筛选获得宿主因子RG4稳定剂TPT和BBM
（图源：Qiyu Tong, et al., PLoS Pathog, 2023）
为明确TPT和BBM对宿主因子蛋白表达的调控作用，研究团队在新冠易感细胞H1299中外源性表达了ACE2、AXL、FURIN、TMPRSS2等多种宿主因子，发现TPT和BBM显著抑制宿主因子蛋白表达；突变RG4结构形成关键位点显著促进相应宿主因子蛋白表达，同时导致TPT和BBM的抑制作用失效（图3）。此外，TPT、BBM处理SARS-CoV-2易感细胞H1299、Vero‑E6均显著下调内源性ACE2、AXL、FURIN、TMPRSS2的表达（图3）。上述研究证实TPT和BBM能够通过稳定RG4结构，抑制关键宿主因子表达，提示其抵抗SARS‑COV‑2感染的潜在作用。
图3. TPT和BBM抑制SARS-CoV-2宿主因子表达
（图源：Qiyu Tong, et al., PLoS Pathog, 2023）
最后，研究团队利用SARS-CoV-2假病毒系统分别在细胞和动物水平检测了TPT、BBM对SARS-CoV-2感染的调控作用。研究发现，TPT和BBM显著抑制SARS-CoV-2原始株、突变株P.1和突变株B.1.617.2感染宿主细胞，并在低浓度时表现出比PDS（RG4经典稳定剂）更高的病毒感染抑制效率（图4）。此外，在SARS-CoV-2易感细胞中过表达ACE2、AXL、FURIN和TMPRSS2显著促进SARS-CoV-2感染宿主细胞，TPT和BBM处理能够阻碍其感染；而破坏宿主因子中RG4结构显著抑制了TPT和BBM对病毒感染的调控作用（图4）。在动物水平，研究团队利用AAV9-hACE2构建了SARS-CoV-2易感小鼠模型，同时连续腹腔注射给予TPT和BBM治疗。结果显示TTP、BBM显著抑制病毒感染小鼠肺部，并伴随着AXL、FURIN和TMPRSS2等蛋白在肺组织的表达下降（图4）。
图4. TPT、BBM抑制SARS-CoV-2感染
（图源：Qiyu Tong, et al., PLoS Pathog, 2023）
图5. 工作总结图：TPT和BBM通过靶向SARS-CoV-2宿主因子RG4抑制病毒感染
（图源：Qiyu Tong, et al., PLoS Pathog, 2023）
通讯作者：傅湘辉教授（左1），田艳副研究员（左2）；第一作者：童麒羽（右2）、刘更（右1）
（照片提供自：四川大学傅湘辉团队）
四川大学华西医院傅湘辉教授和田艳副研究员为论文通讯作者，硕士研究生童麒羽和博士后刘更为第一作者。该研究得到国家自然科学基金重大研究计划、面上和青年科学基金项目等项目资助，得到华西医院呼吸与危重症医学科程伟教授和刘丹教授，以及四川大学生物治疗国家重点实验室戚世乾教授的大力支持。傅湘辉教授负责的“代谢与疾病”研究室以代谢科学为中心，主要探究肿瘤和糖尿病、脂肪肝等重大疾病的发病机制，重点发现疾病共性靶点，并开展相关转化应用研究，相关成果以通讯作者发表在J Clin Invest、J Hepatol、Hepatology、Mol Cancer、Mol Ther、Nat Commun、PLoS Biol、PLoS Pathog、Signal Transduct Target Ther、Theranostics、Trends系列期刊等。欢迎有志于课题组相关研究领域的博士后加入（联系邮箱：xfu@scu.edu.cn）。
参考文献（上下滑动阅读）
[1] Dumas L, Herviou P, Dassi E, Cammas A, Millevoi S. G-Quadruplexes in RNA Biology: Recent Advances and Future Directions. Trends Biochem Sci. 2021;46(4):270-283.
[2] Liu G, Du W, Sang X, et al. RNA G-quadruplex in TMPRSS2 reduces SARS-CoV-2 infection. Nat Commun. 2022;13(1):1444.
[3] Qin G, Zhao C, Liu Y, et al. RNA G-quadruplex formed in SARS-CoV-2 used for COVID-19 treatment in animal models. Cell Discov. 2022;8(1):86.