STAR Protocols︱刘新奇课题组利用慢病毒建立THP-1悬浮细胞系进行免疫染色和激光扫描共聚焦显微镜观察的实验方案

撰文︱张连飞

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

THP-1细胞是从一名患有急性单核细胞白血病的患者的外周血中分离出来的，是一种悬浮生长的人源单核细胞系，广泛用于免疫和炎症研究。然而，该细胞系很难通过常规手段进行转染，对研究者进行相关细胞系的建立造成了很大的困扰。此外，对THP-1这类悬浮细胞系的激光扫描共聚焦显微镜观察也存在诸多难题。这都使研究者在利用THP-1细胞系进行科学研究时面临巨大挑战。

2023年1月22日，南开大学生命科学学院刘新奇课题组在Cell子刊STAR Protocols杂志在线发表了题为“Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy”的实验方案文章（Protocol）。该文章详细阐述了使用慢病毒高效建立THP-1细胞系，以及进行免疫染色和激光扫描共聚焦显微镜观察的方案。该工作流程适用于包括Jurkat细胞系在内的多种悬浮细胞系。自2020年以来，刘新奇课题组已运用本实验流程发表了5篇文章[1-5]，涉及细胞免疫、细胞自噬、细胞凋亡等领域的研究。

在这一工作中，作者以STING（stimulator of IFN genes）为例，详细阐述了在THP-1细胞中建立基因敲除细胞系，以及进行激光扫描共聚焦显微镜观察的相关实验流程，包括慢病毒的生产、THP-1细胞感染和单克隆化、细胞固定和免疫染色以及激光扫描共聚焦显微镜观察。作者首先利用HEK293T细胞进行慢病毒包装，将生产出的慢病毒收集到离心管中，直接离心会导致大部分病毒仍残留在上清液中造成浪费，作者使用慢病毒浓缩液对病毒浓缩过夜后再离心的方法大大提高了收集到的病毒滴度。图1展示了慢病毒离心前后的示意图，可以看出离心后在离心管底部富集大量病毒颗粒。随后，用慢病毒感染THP-1细胞，使用嘌呤霉素筛选并进行单克隆化，Western blotting鉴定基因敲除效果。结果表明，STING敲除效果良好（图2）。该工作为建立基因敲除或过量表达的THP-1细胞系提供了高效的实验方案，极大的方便了THP-1细胞在科学研究领域中的应用。

图1 慢病毒浓缩液富集病毒后的示意图

（图源：Ji W, et al., STAR Protoc, 2023）

图2 在STING敲除的THP-1细胞系中检测STING的表达

（图源：Ji W, et al., STAR Protoc, 2023）

利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态、细胞内蛋白质的定位或转位现象是进行生命科学研究常用的方法之一，激光扫描共聚焦显微技术结合其他生物技术在免疫学、遗传学、形态学等领域得到广泛应用，目前该技术普遍应用于对贴壁细胞的观察与分析。由于THP-1细胞悬浮生长的特性，故对其进行免疫染色和显微观察极其困难。作者采用多聚甲醛边固定边离心的方法有效地使细胞形成贴壁状态，这是对悬浮细胞进行显微观察最困难之处。随后，使用一抗和二抗进行免疫染色和激光扫描共聚焦显微镜观察。图3展示了激光扫描共聚焦显微镜下THP-1细胞内源STING的共聚焦图像，可以看出细胞基本保持原来形态，并无明显变形，而且染色效果良好。

图3 显微镜下THP-1细胞内源STING的共聚焦图像

（图源：Ji W, et al., STAR Protoc, 2023）

图4 利用慢病毒建立THP-1悬浮细胞系进行共聚焦显微镜观察的实验方案

（图源：Ji W, et al., STAR Protoc, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该实验方案系统地介绍了利用慢病毒建立THP-1细胞系，以及进行免疫染色和激光扫描共聚焦显微镜观察的实验流程（图4）。该研究不仅详细阐述了基因敲除或过量表达的悬浮细胞系的建立，还对利用激光扫描共聚焦显微镜观察悬浮细胞提供了重要参考。通过慢病毒感染悬浮细胞的方案，大大提高了建立悬浮细胞系的效率。但在实际操作中，细胞系筛选可能会由于细胞活力较低导致失败。为了解决这个问题，研究者需要保证细胞保持在适当的密度，同时，提高血清的质量也会有较大的帮助。此外，在描述利用激光扫描共聚焦显微镜观察悬浮细胞系的方案中，作者采用多聚甲醛边固定边离心的方法，大大解决了悬浮细胞制片难的问题。值得注意的是，研究者需配备能够进行12孔板离心的离心机。该研究方案还提供了实验过程中可能出现的问题以及相应的解决方案，为研究者进行相关实验提供了重要的参考价值。

原文链接：https://star-protocols.cell.com/protocols/2385

南开大学生命科学学院/药物化学生物学国家重点实验室刘新奇教授和博士毕业生冀旺盛为该工作的共同通讯作者，冀旺盛博士（现就职于河南大学抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室）和博士研究生张连飞为该工作的共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金（31870730）和天津自然科学基金（21JCZDJC00050）的资助。

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本文完