Nat Commun︱温州医科大学李校堃院士团队发现FGF18为肝缺血再灌注损伤的潜在治疗新靶点

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撰文︱童高赞

责编︱王思珍，方以一，郭渺

肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是肝切除术和肝移植术中最常见的并发症，严重影响患者手术预后。然而，肝脏缺血再灌注过程中相关的损伤机制尚未被完全阐明。成纤维细胞生长因子18（Fibroblast Growth Factor 18, FGF18）是旁分泌成纤维生长因子家族的一员，广泛参与各种细胞代谢活动，但是其在肝缺血再灌注损伤中的作用及机制尚不明确。在本项研究中，作者通过一系列体内外实验旨为探究FGF18在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及其具体调控机制。

近日，温州医科大学李校堃院士团队在Nature Communications上发表题为“FGF18 alleviates hepatic ischemia-reperfusion injury via the USP16-mediated KEAP1/Nrf2 signaling pathway in male mice”的论文，该研究证实FGF18在肝缺血再灌注过程中扮演关键作用，其可显著改善肝缺血再灌注过程中的损伤。从机制上来讲，FGF18的保护作用主要是通过减少USP16的表达，从而增加了KEAP1的泛素化修饰水平，进而激活Nrf2信号并最终改善肝脏缺血再灌注损伤。此外，作者发现FGF18对USP16调控作用是通过Nrf2和USP16的负反馈调控来实现的。因此靶向FGF18/USP16/KEAP1信号通路可作为临床上改善肝脏缺血再灌注损伤和相关病理过程的一种新策略。（拓展阅读：李校堃课题组相关研究进展，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：APS︱张金三、李校堃团队发现FGF10有望成为阿霉素心肌损伤防治新靶点）

图1. FGF18在肝缺血再灌注过程中高表达。

首先，该研究发现在肝缺血再灌注过程中，FGF18呈现高表达，并且肝星状细胞是分泌FGF18的主要细胞。研究人员通过临床肝切除样品以及小鼠肝缺血再灌注损伤模型均证实FGF18高表达。随后，作者通过原代细胞实验以及免疫荧光实验进一步证明，在肝缺血再灌注过程中，肝星状细胞（HSCs）是分泌FGF18的主要细胞。此外，培养基转移实验也进一步表明，肝星状细胞分泌的FGF18可作用于肝实质细胞，减少肝实质细胞的凋亡水平。以上结果提示，FGF18在肝缺血再灌注过程中起保护作用。

图2. 肝星状细胞特异性敲除FGF18加重肝缺血再灌注损伤。

为了深入探究FGF18在肝缺血再灌注过程中的作用。作者构建了肝星状细胞特异性敲除FGF18小鼠（Fgf18^△HSC），并构建肝缺血再灌注模型，观察各组小鼠肝脏的HE染色、肝功能以及凋亡情况。与对照组相比，Fgf18^△HSC小鼠的肝脏切片HE染色结果显示其坏死面积明显上升。同时，TUNEL染色以及c-CAS-3免疫组化结果均表明肝脏组织的凋亡水平呈上升趋势，免疫印迹实验也得到同样的结果。此外，作者还发现I/R导致的炎症水平升高在Fgf18^△HSC小鼠中加重。进一步，作者对I/R后的Fgf18^△HSC小鼠和Fgf18^f/f小鼠的肝脏进行了RNA-sequencing测序分析。结果表明：与对照组相比，特异性敲除FGF18肝脏的凋亡和炎症相关因子均明显上升。以上结果均表明，肝星状细胞特异性敲除FGF18可显著加剧肝缺血再灌注损伤。

接着，为了进一步探究FGF18介导肝缺血再灌注损伤的具体分子机制。作者锁定目标于去泛素化酶USP16（Ubiquitin Specific Peptidase 16）。USP16是一种去泛素化酶，广泛参与体内各种稳态调节以及细胞代谢过程，包括信号转导、DNA修复和转录激活等。通过分析公共RNA-sequencing数据库，结果提示USP16在肝缺血再灌注损伤过程中显著上升。作者也通过转基因小鼠（USP16^f/f）进一步证实USP16在FGF18介导的肝缺血再灌注损伤过程中扮演关键作用。

另外，作者通过RNA-sequencing测序分析以及其他一系列实验分析发现，FGF18也可同时调控Nrf2信号通路。考虑到FGF18可同时调控USP16和Nrf2，作者推测USP16可能通过影响Nrf2信号通路介导FGF18改善肝缺血再灌注损伤。正如预期，Usp16^△HEP小鼠肝脏中的Nrf2以及下游HO-1蛋白呈上升趋势。此外，众所周知KEAP1在Nrf2蛋白稳定性的调控中起着关键作用，作者发现，FGF18重组蛋白可显著降低缺氧再复氧情况下肝实质细胞中的KEAP1水平，但其mRNA水平并没有发生变化。进一步实验结果表明，FGF18导致的KEAP1下降在MG132处理的情况下被逆转，但是氯喹处理并没有逆转这一现象。以上结果表明，FGF18导致的KEAP1下降是蛋白-泛素化酶体降解途径依赖的。为了验证USP16是否影响KEAP1,作者首先通过免疫共沉淀以及蛋白质组学技术发现，USP16确实可结合KEAP1蛋白。同时，免疫荧光以及PLA邻位连接技术也同样证实USP16可直接结合KEAP1。以上结果均表明，在肝缺血再灌注情况下，USP16可直接结合KEAP1蛋白并最终影响Nrf2信号通路。

图3. USP16可直接结合KEAP1。

此外，作者还发现USP16可通过K48依赖的方式泛素化修饰KEAP1，并最终参与到FGF18介导的肝缺血再灌注损伤保护过程中。

有意思的是，作者发现Nrf2抑制剂（ML385）可显著增加H/R情况下肝实质细胞中USP16的蛋白和基因水平。体内实验也证实，Nrf2-KO小鼠中USP16的蛋白和基因也同样上升。随后，作者通过JASPAR数据库在USP16启动子区域计算出了Nrf2结合位点，提示USP16可能是Nrf2的转录靶点。为了进一步确定Nrf2和USP16之间的关系，作者通过荧光素酶报告基因实验以及CHIP实验均证实Nrf2可直接结合在USP16的启动子区域上，并且在造模情况下，Nrf2可能通过p65的协同作用共同调控USP16的表达。

图4. Nrf2可通过基因水平调控USP16的表达。

图5. FGF18调控肝缺血再灌注损伤机制图。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本项研究的结果证实，FGF18在肝缺血再灌注过程中扮演关键作用，其可显著改善肝缺血再灌注过程中的损伤，主要体现在通过降低氧化应激以及炎症水平，最终减少肝实质细胞的凋亡。作者通过实验发现在缺血再灌注过程中，肝星状细胞可分泌FGF18并作用于肝实质细胞，从而保护肝实质细胞。从机制上来讲，FGF18的保护作用主要是通过下调USP16的表达，从而增加了KEAP1的泛素化修饰水平，进而激活Nrf2信号并最终改善肝脏缺血再灌注损伤。此外，作者发现FGF18对USP16调控作用是通过Nrf2和USP16的负反馈调控来实现的。因此靶向FGF18/USP16/KEAP1信号通路可作为临床上改善肝脏缺血再灌注损伤和相关病理过程的一种新策略。

该文章也存在一些不足之处，前期已有文献报道FGF18-FGFR3可通过激活Ras途径、磷酸肌醇3激酶（PI3K）以及磷脂酶（PLC）等途径激活下游通路。因此，本实验还有待进一步验证FGF18是通过何种途径激活Nrf2信号通路并最终影响USP16。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41800-x

温州医科大学李校堃院士，丛维涛研究员，温州大学申景岭教授为论文并列通讯作者，药学院博士研究生童高赞，附属第二医院肝胆胰外科陈亦明主任和台州市中心医院药剂科陈茜茜为论文共同第一作者。

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