Genome Med︱浙江大学谢安勇团队发现携带抑癌基因突变的小eccDNA推动CRISPR小鼠肝癌模型肿瘤内异质性演化

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撰文︱陈国巧

审阅︱谢安勇

责编︱王思珍，方以一，郭渺

肿瘤内异质性（intratumor heterogeneity，ITH）是指在一个肿瘤内部的基因型和表型的异质性，遵循着达尔文进化论原则推动肿瘤的发生和发展，是导致临床上癌症诊疗困难的主因之一[1]。然而，作为细胞内的一类遗传物质，染色体外环状DNA（extrachromosomal circular DNA, eccDNA）可以单独存在或重新整合到基因组，特别是携带原癌基因的eccDNA，不遵循达尔文进化论原则，使ITH的演化更为复杂[2]。近年来，利用CRISPR/Cas9的体细胞基因编辑技术，可以建立原发性肝癌小鼠模型，为研究原发性肝癌的发生发展以及ITH的演化提供便利[3-6]。这个小鼠模型也许能够帮助解析eccDNA在原发性肝癌ITH演化中的作用和机制。

2023年10月6日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院/浙江大学转化医学研究院谢安勇教授团队和浙江大学医学院附属邵逸夫医院林辉教授团队联合浙江大学转化医学研究院刘鹏渊教授团队在Genome Medicine杂志上发表题为“Small extrachromosomal circular DNA harboring targeted tumor suppressor gene mutations supports intratumor heterogeneity in mouse liver cancer induced by multiplexed CRISPR/Cas9”的研究论文，揭示携带抑癌基因（Tumor suppressor gene,TSG）突变的小eccDNA是CRISPR/Cas9小鼠肝癌模型ITH演化的重要推动力量[7]。

该研究团队通过CRISPR/Cas9靶向编辑小鼠肝脏的34个抑癌基因，成功诱导了小鼠原发性肝癌模型（图1A）。肿瘤结节组化结果和TSG靶点突变鉴定显示小鼠原发肝癌ITH明显（图1B和1C）。

图1.CRISPR/Cas9小鼠原发肝癌模型的ITH。

为了进一步探索ITH的演化过程，该研究团队利用原发肝癌肿瘤结节，建立单细胞克隆细胞系及其单细胞亚克隆。随后的TSG靶点突变分析显示，单细胞克隆可同时在高达17个TSG上含有靶点突变，而且，基因编辑诱导的单细胞克隆的同一TSG的靶点突变大都是多拷贝，有的甚至高达9个等位靶点拷贝。更令人惊奇的是，单细胞克隆细胞系及其单细胞亚克隆在同一TSG靶点通常含有不同的突变类型和突变频率，甚至有的TSG靶点会出现新的突变类型或丢失原有的突变类型。如果对单细胞亚克隆进行体外培养，分别在不同增殖时间节点对样本进行TSG靶点测序分析，也同样发现同一TSG靶点突变频率与类型可能随着细胞增殖而不断变化，又称突变振荡（mutation oscillation）。

图2.单细胞亚克隆移植瘤形成过程中的TSG靶点突变振荡。

图3.CRISPR/Cas9小鼠原发性肝癌细胞的基因组不稳定性。

进一步将亚克隆细胞系接种到重症免疫缺陷小鼠中，移植瘤形成后从中分离肝癌细胞，建立单细胞克隆，TSG靶点分析显示亲本细胞和移植瘤细胞的TSG靶点突变同样发生了振荡（图2）。这些结果说明这些“超级”肝癌细胞的基因组可能高度不稳定。

图4.小eccDNA携带TSG靶点突变。

事实上，随后的分析显示，这些单细胞克隆的内源DNA损伤应答高度激活，DNA双链断裂标志物gH2AX和53BP1焦点较正常细胞NIH-3T3细胞明显增多（图3A）。同时，微核（图3B）和染色体畸变事件（图3C）也高于NIH-3T3细胞。这些结果提示这些肝癌细胞有明显的基因组不稳定性。由于CRISPR/Cas9在基因编辑过程中可能诱导染色体融合，导致染色体碎裂和eccDNA的产生[8]，该研究团队推测eccDNA的产生可能是TSG靶点突变振荡的诱因。于是，通过Circle-seq[9]，研究团队发现这些小鼠原发肝癌细胞系不仅含有小eccDNA，而且所含有的总的小eccDNA与产生TSG靶点突变的小eccDNA较NIH-3T3更多（图4A）。通过对分离出的小eccDNA和基因组DNA（gDNA）进行二代测序和Sanger测序，发现小eccDNA在TSG靶点编辑位点上，携带了不同类型或频率的突变（图4B和4C），提示携带TSG突变的小eccDNA是影响小鼠原发肝癌发生发展过程中ITH演化的重要来源。

文章结论与讨论，启发与展望

本研究发现携带TSG突变的小eccDNA可能是支持CRISPR/Cas9小鼠原发肝癌ITH演化的重要来源，同时也建立包含高达17个TSG突变的小鼠肝癌单细胞克隆，其基因组高度不稳定，为后续利用同系移植瘤模型研究肝癌肿瘤-免疫微环境以及肝癌耐药机制提供思路和奠定基础。

原文链接:https://doi.org/10.1186/s13073-023-01230-2

通讯作者简介:

该论文通讯作者是浙江大学医学院附属邵逸夫医院和浙江大学医学院转化医学研究院谢安勇教授、浙江大学医学院附属邵逸夫医院林辉教授和浙江大学医学院转化医学研究院刘鹏渊教授，郭涛博士、博士生陈国巧和李旭凡博士是本文的共同第一作者。本课题得到了国家自然科学基金面上项目、浙江省重点研发项目和杭州市重大科技创新项目的支持。谢安勇教授团队致力于肿瘤基因组不稳定性和CRISPR基因编辑原理与改良的研究，已先后在Mol Cell、Nat Struct Mol Biol、Nat Commun、Genome Biol和Nucleic Acids Res等一系列期刊发表学术论文。课题组长期提供技术员和博士后岗位，欢迎联系[e-mail]或[e-mail]。

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参考文献 1. Vendramin R, Litchfield K, Swanton C. Cancer evolution: Darwin and beyond. EMBO J 2021;40(18):e108389.2. Bafna V, Mischel PS. Extrachromosomal DNA in cancer. Annu Rev Genomics Hum Genet 2022;23:29–52.3. Xue W, Chen S, Yin H, et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature 2014;514(7522):380–4.4. Song C-Q, Li Y, Mou H, et al. Genome-wide CRISPR screen identifies regulators of mitogen-activated protein kinase as suppressors of liver tumors in mice. Gastroenterology 2017;152(5):1161-1173.e1.5. Weber J, Öllinger R, Friedrich M, et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112(45):13982–7.6. Tang M, Zhao Y, Zhao J, et al. Liver cancer heterogeneity modeled by in situ genome editing of hepatocytes. Sci Adv 2022;8(25):eabn5683.7. Guo T, Chen G-Q, Li X-F, et al. Small extrachromosomal circular DNA harboring targeted tumor suppressor gene mutations supports intratumor heterogeneity in mouse liver cancer induced by multiplexed CRISPR/Cas9. Genome Med 2023;15:80.8. Leibowitz ML, Papathanasiou S, Doerfler PA, et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet 2021;53(6):895–905.9. Møller HD. Circle-Seq: Isolation and sequencing of chromosome-derived circular DNA elements in cells. Methods Mol Biol 2020;2119:165–81.




本文完