撰文︱李德宝，叶霖财
疾病动物模型是许多临床前研究的基础[1]。缺乏相应的动物模型，即便采用了最尖端的技术，获得的结论也有可能是不完整的，甚至是完全错误的。右心室（RV）流出道梗阻（RVOT）导致了RV压力负荷过载（PO）和肺血灌注减少（RPF）[2,3]，二者是许多儿童心血管疾病，例如法洛四联症（TOF）、肺动脉狭窄（PS）和肺动脉高压（PAH）等，最重要的两种病理生理特征，严重影响了许多患儿的生存率和长期生活质量。然而，由于缺乏新生小鼠RVOT模型，RVPO和RPF是如何调控是如何调控婴幼儿心肺发育很大程度是未知的。因此，尽管婴幼儿的心肺的病理生理特征同成人相比存在很大的差异，儿童心血管治疗的方法从成人研究中直接移植应用，造成了治疗效果的十分有限甚至有害[4]。国际顶尖科研团队采用单细胞测序、谱系示踪和转基因等多种最尖端的技术发现TOF患儿心肌细胞多倍体比例增加并认为是TOF患儿心肌细胞增殖障碍的结果，并以此申请了发明专利开展了临床研究（NCT04713657），相应的研究和评论发表于The New England Journal of Medicine、Science Translational Medicine和J Thorac Cardiovasc Surg等国际顶尖期刊[5]。但他们的研究缺乏相应的动物模型。心肌细胞多倍体增加也可能是心肌细胞增殖的结果（图1）。图1. 心肌增殖导致心肌细胞多倍体细胞增加
其次，在临床实践中，我们通常采用手术方式解除RVOT。RVOT的解除或者尽早解除是否对已经造成的婴幼儿心肺的病理重塑具有逆转作用？如何指导临床手术？这些均不清楚。2023年10月13日，国家儿童医学中心（上海儿童医学中心）叶霖财课题组张浩、孙琦、洪海筏、李明辉、徐秀霞、李德宝、叶霖财等在移植学和外科学的顶级期刊Journal of Heart and Lung Transplantation（JHLT）上发表了题为“A surgical mouse model of neonatal right ventricular outflow tract obstruction by pulmonary artery banding”的研究。本研究构建了新生小鼠RVOT模型，并在新生期对RVOT进行了手术纠治，并用多种分子生物学技术详细描绘了模型的特点以及手术纠治后的效果。该研究不仅充分展现了国家儿童医学中心（上海儿童医学中心）精妙的儿童心血管显微外科技术，也为理解RVPO和RPF调控婴幼儿的心肺发育提供了平台，有望在将来最终改善或者挽救许多患儿的生命，具有重要的临床价值和意义。（拓展阅读：叶霖财团队最新研究成果，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：刘锦纷点评 Cell Biosci︱国家儿童医学中心叶霖财团队在国际上首次创建新生鼠肺静脉狭窄模型）
为了模拟RVOT，研究团队对出生24h内新生大、小鼠进行肺动脉环缩术（PAB）。研究者首先通过低温麻醉新生鼠，造成心脏停搏和可逆性呼吸暂停，以防止在手术过程中过度失血。然后将新生鼠转移到冰床上维持麻醉，以仰卧位固定于体式显微镜下。术中应用正中横向切口开胸（图2），暴露肺动脉，并用28G（大鼠）或30G（小鼠）针头进行环缩，术后关胸并恢复乳鼠体温。通过该方法建模手术死亡率低于5%。由于新生大鼠体积较大，不需要离断胸骨，仅开在2-3肋间开一小口即可进行手术操作，手术时间可控制在10分钟之内。（手术操作视频可在期刊网站进行下载学习）。RVOT形成后第21天，可观察到右心室/右心房的异常肥厚以及肺体积的减少，最终小鼠整体发育迟缓（图3）。以上结果与临床观察到的儿童发育一致，提示RVOT对于儿童的心肺发育具有明显的不良影响，该模型是研究临床疾病的有利工具。为了理解RVOT对心肺发育影响的分子特征，研究人员进行了组织学评估和转录组测序分析。结果显示，RVOT造成了右心室的向心性肥厚、心肌细胞的体积变大，以及心肌肥厚相关基因的显著富集和升高（图4）。RVOT在心肌肥厚方面，新生鼠和成年鼠表现一致。此外，结果提示，RVOT使新生小鼠心肌细胞的增殖标志物pH3和Aurora B等表达明显增多并使增殖相关基因显著富集和升高（图5）。RVOT促进新生鼠心肌细胞增殖提示TOF患儿心肌细胞多倍体的增加很可能是心肌细胞增殖增加的结果。该发现纠正了The New England Journal of Medicine、Science Translational Medicine和J Thorac Cardiovasc Surg等国际顶尖期刊关于TOF患儿病理生理的错误认知，可能中止正在进行的临床研究，挽回巨大的经济损失。RVOT促进心肌细胞增殖的现象不可能在成年动物模型中观察到，也突出了婴幼儿疾病动物模型对于解决婴幼儿临床问题的重要意义。研究人员在新生小鼠RVOT模型中还观察到了RVOT导致的肺泡数量的减少，I型和II型肺泡上皮细胞表达的下降，以及肺泡发育相关基因富集的下调（图6）。研究结果说明RVOT导致了肺泡发育不良。由于90%以上的肺泡发育是在婴幼儿期完成的，该病理生理现象也不可能在成年动物模型中观察到。最后，为了指导临床手术，研究团队通过手术在PAB术后7天解除了新生鼠RVOT。结果显示，解除RVOT后，右心室肥厚显著减少，新生小鼠死亡率得到很大的缓解（图7）。这些结果提示新生鼠心脏具有很强的可塑性，尽早解除梗阻有利于婴幼儿心脏的恢复和远期生存质量的改善。综上所述，该研究成功建立新生小鼠RVOT模型并对RVOT进行了手术干预。RVOT新生小鼠表达为右心房/右心室的肥厚，肺体积的减少以及整体发育的迟缓，与临床RVPO和RPF患儿表现类似，为研究RV PO和RPF调控婴幼儿心肺发育提供了重要的平台。
在新生小鼠RVOT模型中观察到了心肌细胞增殖和肺发育不良等婴幼儿特有的病理生理现象，纠正了国际顶尖团队对于TOF患儿心肌细胞增殖障碍的错误认知，挽回巨大的经济损失，突出了婴幼儿疾病动物模型在临床前研究中的重要价值。
新生小鼠RVOT模型中手术解除梗阻后，新生小鼠的临床表型得到了很大的改善，提示了新生儿心肺具有较大的可塑性，梗阻的尽早解除有利于心脏的早期恢复。
刘锦纷（国家心血管病中心）
右心室流出道梗阻（RVOT）导致了RV压力负荷过载（PO）和肺血灌注减少（RPF），后二者是许多儿童心血管疾病，例如法洛四联症（TOF）、肺动脉狭窄（PS），肺动脉闭锁（PA）等最重要的病理生理特征，严重影响了这类患儿的生存率和长期生活质量。叶霖财团队构建的新生小鼠RVOT模型不仅充分展现了国家儿童医学中心（上海儿童医学中心）精妙的儿童心血管显微外科技术，提出了Science Translational Medicine等对TOF患儿心肌细胞增殖障碍的不同认知，也为理解RVPO和RPF调控婴幼儿的心肺发育提供了平台，为进一步深入研究奠定了基础，有望在将来最终改善或者挽救许多患儿的生命，具有重要的临床价值和意义。
原文链接：https://www.jhltonline.org/article/S1053-2498(23)02074-0/fulltext
上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心硕士研究生李德宝为本文第一作者，心胸外科洪海筏教授和李明辉教授为共同第一作者，心胸外科/心研所叶霖财副研究员为通讯作者，心胸外科孙琦教授和张浩教授为共同通讯作者，上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心为本文第一单位。该工作获得了国家重点研发计划（2019YFA0110401）、国家自然科学基金（82270314,82200309,和82001835)），上海市科委基金（22ZR147900 和23ZR1441100）和宁波市高端医疗团队创新计划（2022020405）等资助。通讯作者简介：叶霖财，副研究员，在哈佛医学院/波士顿儿童医院访问学者，在婴幼儿先心病动物模型方面积累了较丰富的经验，近5年以第一或通讯作者(含共一和共通讯）发表SCI论著41篇，包括心血管专业的权威期刊（Circulation、Journal of Heart and Lung Transplantation、JACC Basic Transl Sci和JTCVS）；授权发明专利7项；负责国家自然科学基金2项、上海市科委创新行动计划和上海市自然科学基金（原创探索类）等项目，是国家重点研发计划子项目（编号：2019YFA0110401）的课题骨干。点评专家简介：刘锦纷，教授、博士生导师，从事先天性心脏病的临床和基础研究，主刀各种先心病手术5000余例，现任国家心血管病中心先心病主任委员，上海市结构性心脏病虚拟现实工程技术中心主任，国务院特殊津贴获得者，获上海市医学会“杰出贡献奖”和国家科技进步二等奖等奖励。原世界小儿心脏外科协管理委员会委员、中华小儿外科常委心胸学组组长。主持完成国家重大科学研究计划、上海市科委基础重点项目/重大项目、国家自然科学基金等项目。转载须知：“岚翰生命科学”特邀稿件，且作者授权发发布；本内容著作权归作者和“岚翰生命科学”共同所有；欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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参考文献 1. Lunney JK, Van Goor A, Walker KE, Hailstock T, Franklin J, Dai C. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 2021 Nov 24;13(621):eabd5758. doi: 10.1126/scitranslmed.abd5758. Epub 2021 Nov 24. PMID: 34818055.2.Li D, Wang J, Fang Y, Hu Y, Xiao Y, Cui Q, Jiang C, Sun S, Chen H, Ye L, Sun Q. Impaired cell-cell communication and axon guidance because of pulmonary hypoperfusion during postnatal alveolar development. Respir Res. 2023 Jan 11;24(1):12. doi: 10.1186/s12931-023-02319-3. PMID: 36631871; PMCID: PMC9833865.3.Gazzaz TF, Elders B, Steve Fan CP, Manlhiot C, Seed M, Yoo SJ, van Arsdell G, Grosse-Wortmann L. The Modified History of Tetralogy of Fallot During Childhood and Adolescence. JACC Cardiovasc Imaging. 2021 Jul;14(7):1478-1480. doi: 10.1016/j.jcmg.2021.01.031. Epub 2021 Mar 17. PMID: 33744148.4. van der Bom T, Winter MM, Bouma BJ, Groenink M, Vliegen HW, Pieper PG, van Dijk AP, Sieswerda GT, Roos-Hesselink JW, Zwinderman AH, Mulder BJ. Effect of valsartan on systemic right ventricular function: a double-blind, randomized,placebo-controlled pilot trial. Circulation. 2013 Jan 22;127(3):322-30. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.112.135392. Epub 2012 Dec 17. PMID: 232473025.Yutzey KE. Cytokinesis, Beta-Blockers, and Congenital Heart Disease. N Engl J Med. 2020 Jan 16;382(3):291-293. doi: 10.1056/NEJMcibr1913824. PMID: 31940705.
本文完