Adv Sci 综述︱华中科技大学梅恒/胡豫团队评述嵌合抗原受体修饰免疫细胞工程化途径和来源策略的最新进展

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撰文︱陈钊钊

审阅︱梅恒

责编︱王思珍

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法近年来已成为治疗难治/复发性血液肿瘤的有效治疗方式。此外，用于肿瘤免疫疗法的CAR技术已从CAR-T扩展到CAR-自然杀伤细胞（CAR-NK）、CAR-细胞因子诱导杀伤细胞（CAR-CIK）和CAR-巨噬细胞（CAR-MΦ）[1, 2]。然而，体外生成自体CAR产品的高成本和复杂制备流程已限制了该技术的广泛应用。自体CAR产品来源于患者自身的免疫细胞，属于个体化精准医疗的范畴，并无移植物抗宿主病（GVHD）的风险。但免疫细胞的“质”和“量”高度依赖于癌症患者的自身状况。据报道，自体T细胞可能会因为抑制性的肿瘤微环境而大规模功能失调和耗竭[3-5]。此外，对于T细胞白血病患者，可用于生产CAR-T的高质量自体T细胞极为有限。因此，亟需开发一种高效经济的全新模式，以探索新的工程化方法和来源策略，生成CAR免疫细胞，造福广大恶性肿瘤患者。目前，研究人员正在积极探讨和优化这些“活细胞药物”的来源和生产途径。

近日，华中科技大学同济医学院附属协和医院梅恒教授/胡豫教授团队在Advance Science发表了题为“Advances in CAR-Engineered Immune Cell Generation: Engineering Approaches and Sourcing Strategies”的最新综述文章，作者讨论了病毒和非病毒递送载体在CAR-免疫细胞基因修饰中的应用。综述了体外制备的自体CAR-T细胞、供者来源CAR产品、第三方来源CAR-免疫细胞和“现货”CAR疗法等不同来源细胞制剂的最新研究进展，系统讨论了各类CAR产品的优缺点，并对CAR技术在非肿瘤疾病中的广大应用前景作出了展望。

第一部分 用于CAR工程化的基因递送技术

基因递送载体是用于CAR工程化的关键组成部分，用于将CAR基因引入免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、CIK细胞和巨噬细胞等，以使它们具备优异的抗肿瘤能力。这些载体是用于将CAR基因引入细胞的工具，其中两种常见的类型是病毒载体和非病毒载体。

常用的病毒载体包括慢病毒、腺相关病毒（AAV）和γ-逆转录病毒，非病毒载体包括转座子/转座酶系统、CRISPR/Cas9系统和mRNA，各自优缺点如下:

第二部分 体外制备的自体CAR-免疫细胞

传统上，自体CAR-免疫细胞制备流程相对标准化，包括以下步骤:1）白细胞分离；2）T细胞的活化和扩增；3）利用CAR基因载体转导T细胞；4）体外CAR - T细胞扩增；5）细胞制剂的包装和冷冻保存；6）回输。在此过程中，需要执行严格的质控和释放标准以保证最终CAR-T产品质量的完整性，其中包括生产材料（特别是基因载体）的控制、过程控制和测试、释放测试、生产过程的验证以及涉及CAR表达水平、淋巴细胞亚群、细胞纯度、活细胞数量和比例的稳定性研究，体外效价、微生物安全性（无菌检查、支原体检查、可复制病毒检测、微生物快速检测、内毒素检测等）。这一过程极其漫长繁杂，长达7~22天，减少了患者对细胞治疗的可及性[6, 7]。

第三部分 供者来源CAR-免疫细胞

鉴于自体CAR 产品高度依赖于足够数量的内源性免疫细胞，患有淋巴细胞减少症或同种异体造血干细胞移植后复发的癌症患者可能会利用供者来源CAR-免疫细胞。首先，与癌症患者体内的自体CAR-T细胞相比，来自健康供体志愿者的CAR-T细胞表现出更强的T细胞适应性和癌症杀伤能力。并且，健康供者来源的CAR-T细胞本身具有独立于CAR的移植物抗白血病（GVL）功效[8, 9]。关于供者来源CAR-免疫细胞的临床试验方兴未艾，显示出了强大的疗效：

第四部分 第三方来源CAR-免疫细胞

第三方来源CAR-免疫细胞系将来自于非HLA匹配供者、脐带血和永生化细胞系的免疫细胞通过基因修饰而获得的细胞治疗产品。

由于人循环T细胞约90%为αβT细胞[10]，非HLA匹配供者来源CAR-T细胞存在并发GVHD的隐患。另一细胞亚群γδT细胞不参与GVHD，一旦激活即可以非MHC限制性杀伤肿瘤细胞[11]，目前关于非HLA匹配供者来源的CAR-γδT治疗相关的临床试验甚嚣尘上。

脐带血来源的CAR-免疫细胞具有多项优势，使其成为有前途的治疗选择[12]。首先，脐带血相对容易获得。此外，脐带血富含多能干细胞，可以分化为多种不同类型的免疫细胞，包括T细胞和NK细胞，这对于CAR基因修饰非常有利。脐带血来源的细胞通常对患者免疫系统的排斥反应风险较低，因为它们通常较为幼稚，表面标志物也不易受到免疫系统的识别。更重要的是，脐带血来源的细胞对供体匹配的要求较低，因此更容易找到合适的供体，从而减少了患者等待CAR-免疫细胞治疗的时间。

永生化细胞系来源的CAR-免疫细胞具有一些显著的优势。首先，这些细胞系是经过工程处理，以确保其能够持续增殖和表达CAR，从而提供更持久的治疗效果。其次，这些细胞系具有更高的一致性，因为它们是从单一细胞系中衍生出来的，减少了供体变异的影响，提高了治疗的可预测性。此外，永生化细胞系还可以在大规模制备中提供更多的一致性和可控性，降低了生产成本。例如，用于NK-92和Raw264.7细胞系可分别用于生产CAR-NK和CAR-MΦ[13, 14]。

第五部分 “现货”CAR产品

“现货”CAR-免疫细胞具有一些显著的优势。首先，这些免疫细胞是提前生产并储存的，可立即供患者使用，从而实现更快速的治疗干预，对于那些病情急迫的患者尤为重要。其次，它们适用范围广泛，可以用于多种癌症类型，而无需为每位患者制备特定治疗产品。此外，批量生产现货CAR-免疫细胞降低了生产成本，提高了可控性和一致性，有助于降低潜在的变异性，提高治疗的可预测性。研究团队对现行的三种现货细胞治疗产品：异基因通用CAR-免疫细胞、诱导多能干细胞（iPSC）来源CAR产品和体内原位编辑CAR技术，分别综述了最新研究进展，并讨论了各自的优势和不足。

异体通用CAR-免疫细胞技术是通过对健康人分离的免疫细胞进行基因修饰来表达CAR，克服了部分患者内源性免疫细胞不足的问题。不同于自体CAR-T细胞，同种异体通用CAR产品必须经过一系列进一步的基因编辑，以避免供体和受体之间MHC不匹配导致的GVHD[15]。

iPSCs来源的CAR-免疫细胞是一种创新性的免疫治疗方法，由于iPSCs具有无限的增殖潜力，理论上可以作为CAR-免疫细胞的无限来源。该策略利用iPSC技术将患者的体细胞（如PBMC）重编程成iPSC，然后将这些iPSC分化成CAR-免疫细胞[16]。这一方法具有几个重要特点和优势。首先，iPSC的使用允许定制化治疗，因为它们可以从患者自身获得，从而降低了免疫排斥风险。此外，iPSC来源的CAR-免疫细胞有望提高治疗效果的持久性，因为它们可以更持久地存在于患者体内。目前已有大量研究分别探讨了iPSC来源的CAR-T、CAR-NK、CAR-MΦ和CAR-中性粒细胞在肿瘤治疗中的有效性。

体内原位编辑CAR-免疫细胞是另一种重要的“现货”CAR疗法。研究人员着重介绍了该新兴免疫治疗策略，后者旨在利用工程化的体内基因递送载体，在体内特异性识别目的免疫细胞，通过基因修饰，原位生成CAR-免疫细胞，而非体外制备再回输。

常见的体内递送病毒载体包括工程化慢病毒和AAV。为消除广泛嗜性，研究人员选择非VSV-G假病毒载体，并通过基因修饰使得病毒包膜表面表达靶向目的免疫细胞的ScFV（如CD3、CD4和CD8），以进一步重定向[17]。

AAV载体具有低免疫原性和无插入突变风险的优势。已有研究通过AAV体内原位生成CAR-T细胞，并成功消除白血病细胞[18]。

基于生物材料的递送载体亦是原位编辑的重要方面。目前用于体内生成CAR-免疫细胞的生物材料包括阳离子聚合物、脂质纳米粒（LNP）、大型封装制剂等。

总结与展望

鉴于CAR-T疗法在肿瘤学中的成功应用，有必要发展更多新技术和改进操作流程的策略，以降低成本并增加可及性。不断发展的细胞来源和工程方法揭示了改善CAR免疫细胞供应和简化CAR产品制造的新途径。多样的来源策略，包括自体、供体来源、第三方和现货细胞产品，揭示出具有不同属性和潜力的细胞库。巧妙的工程方法推动了CAR免疫疗法的优化。基因编辑、合成生物学和多基因整合等技术使免疫细胞具有增强的持久性、特异性和安全性。目前，恶性肿瘤仍然是CAR免疫疗法的主要适应症。然而，CAR-T技术已扩展到治疗非肿瘤疾病。例如，基于LNP的体内CAR-T已被用于心脏纤维化的治疗。其他疾病包括逆转衰老的CAR-T、针对人类免疫缺陷病毒（HIV）的CAR-T，以及肺曲霉病、用于难治性系统性红斑狼疮（SLE）的CD19靶向CAR-T、抗合成酶综合症、用于治疗天疱疮和肌特异性酪氨酸激酶肌无力（MuSK MG）的嵌合自身抗体受体T细胞（CAAR-T）以及用于结肠炎和多发性硬化症（MS）的嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR-Tregs）。因此，从多样的来源和工程方法扩展CAR免疫细胞的应用可能会带来更长远的发展，未来需要进一步的研究来全面阐明这些先进治疗的长期安全性和疗效。

制定标准化的来源和工程化途径对于确保细胞治疗产品质量的完整性至关重要。医疗中心、生物技术行业、制药公司和纳米技术研究所之间的加强协作有望加速这些前沿方法的临床转化，并改变癌症和其他疾病的治疗格局。

原文链接：10.1002/advs.202303215

陈钊钊博士为文章第一作者，梅恒教授、胡豫教授为共同通讯作者。本文章获得国家自然科学基金面上项目和科技部重点研发计划等项目经费支持。

陈钊钊（左）， 梅恒（中），胡豫（右）

（照片提供自梅恒/胡豫团队）

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本文完