基于Edman降解法的蛋白质N-端测序分析
蛋白质是由一条或多条肽链组成的生物大分子，每一条多肽链含有二十至数百个氨基酸残基不等，各种氨基酸残基按一定的顺序排列。几乎所有的蛋白质合成都起始于N-端，蛋白质N-端的序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着巨大的影响力。例如N-端序列影响蛋白质的半衰期，同时关联着蛋白亚细胞器定位等，这些与蛋白的功能和稳定性息息相关。对蛋白进行N-端测序分析，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。
蛋白N端测序方法主要分为两大类，其一为质谱技术，其二为非质谱技术，如经典的埃德曼（Edman）降解法；基于PCR扩增的蛋白质测序，利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列。各技术都有其使用的长处和制约之处。蛋白质的测序可追溯到1950年，Sanger采用2,4-二硝基氟苯(DFNB)法，手工完成了胰岛素51个氨基酸序列的测定，这是人们首次完成的蛋白质一级结构测定[1]。1967年， Pehr Edman和Begg开发出第一台蛋白质自动测序仪，开启了用仪器测定蛋白质序列的新篇章[2]。随着蛋白质测序仪的研制，基于Edman降解法的测序时间大大缩短，同时也减少样品的用量，提高了分析精度和准确性。
Edman降解原理
Edman降解法由埃德曼(P. Edman)所创立。即在弱碱性条件下使多肽/蛋白与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，然后用酸处理，从多肽链上仅使氨基末端残基以氨基酸的苯基乙内酰硫脲衍生物的形态游离出来，然后进行分析。根据反应试剂或衍生物的缩写，本法亦称PTC法或PTH法，反应过程由以下过程组成：
1、耦合
异硫氰酸苯酯（PITC）在多肽链的N末端在碱性环境下与a-氨基反应，形成末端残基的苯硫代氨基甲酰基衍生物。
2、环化裂解
以三氟乙酸（TFA）处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N-端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物（ATZ）。主要化学反应如下：用TFA处理PITC修饰的肽会导致分子内环化，其中PITC加合物的硫脲与第一个肽键的羰基成分反应。 这种环化作用释放出与第一个氨基酸缀合的PITC，形成一个新的N末端胺进行循环反应。
3、转化
通过有机溶剂(乙酸乙酯或氯丁烷)的萃取，将ATZ残基从肽中分离出来，在强酸性条件下转化成更稳定的苯硫基乙内酰脲（PTH）形式。一些修饰过的氨基酸残基(如糖基天冬酰胺)在有机溶剂中溶解性差，因此在序列中相应的位置出现空白。
4、PTH残基分析
由Edman化学反应的每个循环产生的PTH残基通常由高效液相色谱法进行识别。通过与标准品比较，依次鉴定和定量衍生自每个循环的PTH氨基酸残基，并根据残基从N端到C端的顺序对序列进行测定。
样品前处理
Edman降解反应中如果蛋白质N端氨基已被乙酰基、甲酰基或焦谷氨酰胺基阻断，造成没有游离N末端与PITC反应，则须通过化学或酶促方法切割以产生具有游离N末端的片段。因此对于不同的蛋白样品类型需根据需要进行相关前处理再进行分析：
1. 对于不含盐的蛋白样品，可直接滴到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上进行Edman降解分析；
2. 对于高盐蛋白溶液样品，需先进行脱盐处理。可利用可拆过滤头、注射器、PVDF膜、EP管组装简易除盐装置。PVDF膜经活化后，注入加水稀释后的样品进行清洗除盐，之后可取出加载样品的PVDF膜进行分析；
3. 对于抗体样品，可先进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离后，电转印至PVDF膜上，使用丽春红染液进行染色，待自然晾干后分别剪切重链和轻链的条带，再依次进行分析。对于焦谷氨酸环化封闭样品，可利用焦谷氨酸氨肽酶先进行焦谷氨酸去除，再进行SDS-PAGE电泳和电转印，之后再进行分析。
Edman案例分享
某客户待测蛋白样品，经SDS-PAGE鉴定为一条带，HPLC分析为一个主峰，纯度可达到98%以上。样品测试前使用混标（20个PTH—氨基酸的混合物）对仪器进行校准，利用等度条件进行氨基酸分离，校准色谱图如下。
样品经脱盐之后取5 μL（200 pmol）滴到PVDF（聚偏氟乙烯）小膜上，利用PPSQ-53A反应器的余温自然干燥，再使用两片PTFE（聚四氟乙烯）膜包夹PVDF膜，装入PPSQ反应器中进行反应，测试样品N-末端前15个氨基酸的序列。
下图为此蛋白的氨基酸测序结果，共计15个氨基酸，测得的序列为GDKETGQIINTTKEE。每个测算序列都给出4个可能性最大的匹配结果，以第一个结果为本次测序结果。
小结
蛋白质测序能够为蛋白质结构提供许多必要的信息，如为DNA 序列分析找出探针、确定蛋白质生物活性部位，酶与底物结合及催化位点、确定核酸密码中与蛋白质序列的起始位点及结束位点等，同时还能为蛋白质和肽类纯度鉴定提供参考依据。此外，在蛋白质药物中也能经常观察到一些N端的变化，包括N端信号序列的不完全处理、焦谷氨酸的形成、以及N端甲硫氨酸残基的缺失等。N端测序是一项重要的蛋白药物质量控制分析要点，ICH Q6B同样要求对药物进行N端序列确认。蛋白质测序仪PPSQ-53A的灵敏度在pmol级，搭配有HPLC系统，自动化程度高，能够为蛋白质N-端序列提供快速高质量的测试分析。
参考文献
[1] Edman, P.; Hogfeldt, E.; Sillen, L. G.; Kinell, P.-O. Acta Chem. Scand. 1950, 4, 283.
[2] Edman P.; Begg G. Eur. J. Biochem. 1967, 1, 80.
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