19世纪以来，全球的生物制药工业经历了小分子药物和蛋白类药物两大浪潮，但二者的研发受到靶点可成药性的限制，开发难度不断增加。而小核酸药物的发现为业界带来了曙光，由于其作用于基因转录和翻译过程，因此小核酸药物可从根源上调控致病基因的表达，解决某些疾病的蛋白靶点难以成药的问题。虽然小核酸药物真正上市的时间较晚，但是从科研的阶段来看，小核酸药物是比当下火热的PD1抗体更早发现的划时代诺贝尔奖级别治疗手段。ASO的概念首次在1978年被哈佛大学科学家发现，而获得诺奖的 RNAi技术在1998年在Nature上发表，同年FDA批准了全球首款ASO药物Vitravene上市，用于治疗艾滋病人的眼部CMV病毒感染。自此大量科研力量聚焦于新领域，产业界也逐渐拉开了第三次药物研发浪潮的序幕。然而这一波新的研发浪潮却非一帆风顺。由于裸RNA的不稳定性和阻碍RNA进入细胞的生物屏障的存在，在临床上实现小核酸药物的广泛应用仍然具有极大的挑战性。行业曾经历两次泡沫破灭的低谷，在不断推进临床试验的同时，也不断曝出严重的安全性事件，彼时RNAi效应遭到了有效性和安全性双重质疑，如2003年Fomivirsen因销售额过低退市，随后3个ASO药物III期临床接连失败后，多家大药企放弃并出售小核酸开发的平台。临床失败让小核酸药物的天然缺陷浮出水面：1）寡核苷酸在血液中不稳定，半衰期短；2）主动靶向性差；3）核酸药物自身带有负电荷与细胞膜之间存在排斥作用，导致其细胞内吞和逃逸内涵体能力差。而困境之中也蕴含着生机，小核酸药物发展历程中划时代的两大技术——化学修饰和递送技术的出现，让行业重回正轨，进入快速发展的新篇章。
纵观行业震荡发展的时期，可以看到行业的两次低谷都与化学修饰的担忧有关。天然存在的小核酸具有较差的稳定性和非常低的特异性，伴随许多体内副作用。化学修饰通过在特定位置进行化学修饰，提高这些小核酸分子的稳定性、避免激发免疫系统反应，并利用真核细胞中已有的酶来行使它们的功能。自60年前首次对化学修饰进行表征以来，科学家们已经在RNA中表征了170多种化学修饰，化学修饰技术也经历了一次次迭代过程。早期的小核酸药物通常使用 2’-OMe、2’-F 或 PS 进行部分修饰，目前均已采用全修饰，并朝着多样化精细化的方向发展。1）骨架修饰：使用较多的骨架修饰为硫代磷酸(PS)键修饰是通过利用硫原子取代磷酸二酯中的一个非桥接氧来实现的，PS连锁使修饰的寡核苷酸具有对核酸酶的抗性，与未修饰的寡核苷酸相比，这些寡核苷酸更容易与血浆蛋白结合，延长半衰期；2）核糖修饰：核糖修饰可影响小核酸和靶标RNA的亲和力、对核酶的稳定性以及与RNA结合后的性质。目前，较常使用的修饰是2’-O-甲氧乙基修饰（2’-MOE），已上市药物Nusinersen的序列上的每个核苷酸都采用了2’-MOE修饰，临床阶段的其他许多药物也采用该修饰。3）碱基修饰：通过对碱基的修饰，可以加强药物与mRNA碱基之间的相互作用。目前唯一广泛被使用的碱基修饰，就是嘧啶环上的C5甲基取代（5-Methylcytosine）。采用此种修饰的ASO主要集中于RNase H1这条技术路径之中。药效差？--”GalNAc递送系统”显著增强递送效率和安全性
小核酸药物的发展史很大程度上依赖递送技术的进步，递送方式是小核酸药物能否进入细胞发挥作用的关键。目前使用较多的递送技术分为裸露RNA修饰递送技术、脂质体纳米递送技术、共轭连接递送系统（小分子配体、抗体及其他分子）等。其中，LNP和GaINac技术相对成熟。开发自Arbutus公司的LNP（脂质纳米颗粒）是应用最早的递送系统，第一款siRNA药物Patisiran就采用了LNP，但应用上容易引发过敏等不良反应。为实现更精准靶向及稳定性，GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）递送技术在2014年被Alnylam实现，是小核酸药物发展历程中的重大突破。作为半乳糖氨基糖衍生物的GalNAc，是肝细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的高亲和力靶向配体，与ASGPR结合后能通过细胞内吞作用，进入到细胞内形成内涵体，从而将足够数量的siRNA带入细胞内，诱导选择性RNA沉默反应。GalNAc技术在小核酸药物领域的应用被广泛研究。2019年FDA批准了全球首款GalNAc-siRNA偶联物Givlaari，用于治疗急性肝卟啉症（AHP），给药频率为每月1次。从此，GalNAc技术开始在小核酸药物中发挥越来越重要的作用。迄今已有四款应用GalNAc技术的siRNA药物被FDA批准上市，与GaiNac共轭的小核酸药物也是当前最火热的管线。全球小核酸药物临床管线的递送系统中，GaiNac共轭的递送系统研发最火热
GalNAc递送系统的优势在于：可以通过皮下注射的方式达到较好的药物分布效果，并且作用时效长达数月；由于高效靶向肝脏，所需药物剂量小，副作用小。以ATTR领域上市的小核酸药物为例，包括ASO药物Tegsedi（裸RNA）、siRNA药物Onpattro（LNP为载体）、Amvuttra（GalNAc偶联药物），其代表了发展了三代的递送系统。相比仅经过化学修饰的Tegsedi和通过LNP包裹的Onpattro，采用GalNAc修饰递送的升级版药物 Vutrisiran和Eplontersen在临床试验中表现出了良好的安全性和长效作用特点，vutrisiran在每三个月给药一次的频率下，能达到类似于每3周给药一次30mg patisiran降低血浆TTR效果。更高效、更安全？龙头企业围绕修饰技术+递送技术持续升级
核酸药物无论化学修饰还是递送系统都具有平台效应，创新性平台公司往往能基于前期的经验和优势对小核酸药物研发技术进行不断升级，从而使药物达到更高效、更安全的应用效果：Ionis公司通过在在GalNAc递送技术和修饰技术上的迭代，实现了药效的显著提升。修饰技术上，Ionis已发展了2.5代化学修饰技术，从而大大提升药物的有效性，研究数据表明与2.0代药物相比使用的2.5代化学修饰技术的药效可以提高10倍。递送技术上，Ionis的配体共轭反义（LICA，ligand conjugated antisense）技术平台，能够将更大剂量的ASO递送到所需细胞和组织，并实现了不但让ASO药物可以通过多种方法给药，而且可以送达到人体的不同器官和组织中。2、Alnylam--siRNA领域的先行者
Alnylam经过近20年的坚守与积累，如今已建立了围绕化学修饰和递送技术的护城河。核心GalNAc技术不断升级，从 STC 到 ESC 再到 ESC+，通过不同的RNA修饰持续提升GalNac的靶向性以及药效。此外，公司还在开发其它创新 RNAi 技术，包括旨在同时靶向两种不同 mRNA的Bis-RNAi技术，和能够迅速并且特异性逆转RNAi 的基因沉默效果的 Reversir 技术。目前，包括ASO、siRNA、aptamer、sgRNA、miRNA、saRNA等小核酸药物处于不同的发展阶段。全球小核酸药物临床在研管线中约有 7% 进入了临床三期。ASO和siRNA目前仍是小核酸药物领域的热点赛道。
2021年小核酸药物全球市场规模达到35亿美金，预计2025年将达到116亿美金市场，突破百亿市场大关的主要驱动力被认为来自于新的递送技术的突破。
目前主流的被研究用于小核酸药物的递送技术除基于脂质的递送系统LNP外，还有细胞天然递送物质外泌体（exosome）、siRNA-配体偶联、核苷酸衍生纳米颗粒以及基于聚合物的siRNA递送等。其中，外泌体被认为最具有潜力去解决小核酸药物在体内递送瓶颈，是近年来的研究重点。外泌体是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，主动向胞外和体液中释放的纳米级双层囊泡小体，通过转移内容物（即核酸、蛋白质和脂质）来促进细胞间通讯。外泌体在各种生理和病理过程中发挥着关键作用，包括癌症、妊娠障碍、心血管疾病和免疫反应。与LNP相比，其作为载体系统具有以下的优势：外泌体表面的标志物蛋白CD47和其他内源性信号配体可以通过抑制单核吞噬细胞系统（MPS）清除和提高细胞摄取来延长体内循环的时间，其效果更优于脂质体； 外泌体可以循环至人体所有的腔室，具有比较好的组织选择性。例如血脑屏障； 外泌体是内源性的纳米颗粒，免疫源性较低，因此安全性高，已被安全地用于移植物抗宿主病（GvHD）患者； 某些来源的外泌体已被证明具有固有的促再生和抗炎特性，可能会增强小核酸药物递送的效果。
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外泌体信号传递示意图
由于外泌体在临床应用中的巨大前景，已经形成了一条与外泌体研究相关的商业链。目前，Codiak公司、M. D. Anderson Cancer Center等开发的外泌体递送的siRNA药物已进入I期临床研究。此前，Codiak公布的临床前数据，证明了装载有反义寡核苷酸（ASO）的工程化外泌体对肿瘤相关的巨噬细胞进行选择性重编程并产生有效的抗肿瘤活性的潜力。目前最具代表性的GalNAc-siRNA偶联物已被验证，随着ADC药物技术的成熟，靶向修饰也成为多家药企下一代递送系统发展的重要方向，给核酸带上“导航”定向转运至目标器官。在研靶向修饰的探针多样，有小分子、适配体、多肽、生物大分子等。抗体寡核苷酸偶联物（AOC）就是将治疗性寡核苷酸（siRNA、PMO等）与靶向抗体、连接结合，利用抗体将寡核苷酸递送至特定细胞或组织，从而减少治疗所需要的用药量并解决靶向寡核苷酸递送问题。对于小核酸药物，可被靶向的受体蛋白包括HIV
gp160蛋白、HER2、CD7、CD71、CD44、EPHA2、EGFR等。Avidity的AOC产品AOC1001，是首个进入临床的AOC药物，由3部分组成：靶向转铁蛋白受体1（TfR1）的全长单抗、linker、靶向DMPK mRNA的siRNA。其用于治疗强直性肌营养不良型1型（DM1）疾病，在2021年11月已经进入I期临床试验。动物实验表明，单次剂量2mg/kg
siDMPK, 在猴子体内观察到DMPK mRNA持续下降~75%。与核酸适配体的偶联也被也已被探索用于增强小核酸分子向特定靶细胞的递送效果。核酸适配体能够以高亲和力与对应的靶蛋白结合，相较于抗体有诸多优点，如稳定性高、结合能力强、便于修饰、成本低等。目前，适配体与siRNA、shRNA以及miRNA进行偶联，被认为可以用于治疗癌症或一些自身免疫疾病。多肽偶联也是目前小核酸药物偶联递送研究的一个重要方向，其作用主要依赖于靶向肽或穿膜肽的特性。多肽偶联的优势包括分子量小、可任意非天然氨基酸改造来延长半衰期、杂质控制及降低副作用优势明显等。多肽偶联的研究中最常用的设计是将多肽与电中性的ASO（如PMO和PNA）直接化学偶联。Ionis、Alnylam等领先玩家均在该领域布局。目前已有多种核苷酸衍生的纳米颗粒被报道可用作小核酸药物递送系统，比如四面体DNA纳米颗粒，球形核酸（SNA）、具有多个shRNA拷贝的三元连接RNA纳米颗粒，RNAi微海绵等。
聚合物的最终结构可通过化学合成方法来确定，物理化学性质可通过自下而上的化学合成来调节，PLGA已广泛作为微球制剂载体应用。用于siRNA递送系统的聚合物研究，从最早的聚乙二醇缩氨酸（PEG）和聚乳酸-共乙醇酸（PLGA）与siRNA偶联，到后面的多离子复合物（PIC）与siRNA偶联，siRNA-聚合物生物偶联物显示出相当的潜力。
siRNA-聚合物生物偶联物的结构由线性和支链两种类型随着修饰技术与递送技术的发展，小核酸药物将不断助力人类攻克医学难题，由小核酸药物推动的大时代前景广阔值得期待！
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