间充质干细胞衍生的细胞外囊泡（MSC-EVs）：下一代治疗工具？

间充质干细胞（MSC）可以从包括骨髓、脐带和脂肪组织在内的各种组织中分离，具有自我更新和多向分化的潜力。研究表明，间充质干细胞的治疗效果主要取决于其旁分泌作用，而细胞外囊泡（EVs）是间充质干细胞的主要旁分泌物，在细胞间通讯中起着至关重要的作用，存在于各种体液和细胞上清液中。由于MSC衍生的EVs保留了原细胞的功能并具有较低的免疫原性，因此它们具有广泛且有前景的治疗应用，比细胞治疗具有优势。在这里描述了MSC-EVs的一些特征，并讨论了它们在免疫调节和再生中的作用，重点介绍了MSC-EVs的分子机制及其在治疗纤维化和组织修复中的应用，指出了MSC-EVs临床应用中的当前挑战以及克服质量异质性问题的潜在方法。

特性

● MSC-EVs具有低免疫原性和强大的治疗应用潜力；

● MSC-EVs用于治疗组织纤维化和促进组织再生；

● MSC-EVs是一种新的治疗制剂来介导免疫调节和促进再生；

问题与挑战

● MSC-EVs介导免疫调节和再生的机制？

● MSC-EVs用于纤维化组织的再生的机制？

● 如何实现MSC-EVs的大规模生产，并克服质量异质性问题？

● MSC衍生的基于EV的免疫调节和再生在临床实践中面临哪些挑战？

细胞外囊泡组成

细胞外囊泡是由细胞释放，存在于体液中，具有膜结构是一类小泡。根据直径，它们可以分为四个亚组：外泌体（30–150 nm）、微泡（100–1000 nm）、凋亡小体（50–5000 nm，在细胞凋亡期间产生）和在癌细胞中新发现癌小体（1–10μm）。EVs包裹了许多生物活性分子，如蛋白质、脂质、核酸和细胞器（图1），这些分子可以被递送到靶细胞。大量数据表明，外泌体和微泡是EVs在许多生理（病理）过程中的重要介质。

▲图1细胞外囊泡的形成和主要类型：A外泌体来源于内泌体途径，B外泌体的组成

外泌体
Exos

外泌体是密度为1.11–1.19 g/mL的微小囊泡，在电镜下观察时，它们具有典型的“圆盘状”结构和扁平的球形，在外泌体的形成过程中，细胞外成分和细胞膜蛋白被内陷的质膜包裹，形成早期内泌体。它们可以与细胞内细胞器交换物质，并发育成晚期内体，最终形成细胞内多血管体（MVBs），MVB含有许多管腔内小泡（ILV）。它们可能通过与自噬体或溶酶体融合而降解并释放到细胞质中，或通过与质膜（包括ILVs）融合而释放到细胞外，从而形成外泌体，外泌体介导的细胞间通讯是通过直接膜融合、受体介导的内吞作用、吞噬细胞作用和微胞饮作用实现的。参与外泌体生物发生（如转运和融合）的蛋白质包括Rab GTP酶、ESCRT（转运所需的内体分选复合物）、膜联蛋白、脂蛋白和四次跨膜蛋白（CD63、CD81和CD9）。此外，它们还含有参与MVBs的凋亡链接基因2相互作用X(Alix)和肿瘤易感基因101蛋白质（TSG101）、胆固醇、神经酰胺、提供结构稳定性的磷酸甘油酯，以及参与抗原结合和呈递的免疫相关分子MHC-II，外泌体还携带可以在细胞之间转移的功能性mRNA和miRNA。肿瘤释放的外泌体含有单链DNA，基因组DNA、cDNA和转座元件。

细胞微泡
MVs

MVs的生物发生与外泌体不同，因为当细胞受到刺激或凋亡时，它们是从质膜的向外出芽和分裂中释放出来的。它们具有高度生物相容性、低免疫原性和低靶向性的特点，可以用作药物载体。研究表明，使用肿瘤细胞衍生的MV来输送化疗药物可以产生更好的癌症治疗效果，且副作用和不良反应很少。

间充质干细胞来源的细胞外囊泡

尽管间充质干细胞来源多种多样，但它们在培养中都可以粘附，并分化为具有特异性表面标记的多种细胞类型。随着MSCs临床治疗的需求，国际细胞治疗学会（ISCT）的间充质和组织干细胞委员会提出了鉴定人MSCs的最低标准：（1） 在标准条件下培养，它们必须粘附在基质胶上；（2）流式检测MSC表面标志物CD105、CD73和CD90的阳性表达率应达到95%，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19或HLA-DR的阴性表达（≤2%阳性）；（3） 通过体外标准方法诱导后，MSCs必须能够诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。尽管如此，进一步的研究表明，这些标准并没有完全定义MSC。越来越多的证据表明，异质性骨髓间充质干细胞具有多个特征性表面标记的细胞亚群，但表面标记的定义和这些亚群的生物学功能需要不断探索。

间充质干细胞易于在体外复苏和增殖，使其能够大规模生产用于临床应用。近年来已成为临床应用中研究最多的干细胞类型，并在移植物抗宿主病（GVHD）、肾损伤、组织和器官移植、免疫耐受、神经损伤、风湿病和肝病中发挥了有效的治疗作用。此外，MSC在新冠肺炎大流行背景下引起了广泛关注。有研究者证明在MSC治疗组中，由于调节白细胞介素10（IL-10）表达增加、抑制过度活化的免疫T细胞和NK细胞以及显著降低TNF-α表达水平，这使新冠肺炎感染患者得以治愈或病情显著改善。

尽管MSC疗法具有优势，但仍有一些方面值得考虑。首先，在体外培养过程中，随着传代次数的增加，MSCs的增殖能力逐渐减弱，并伴有一定程度的分化甚至衰老。这影响了它们的调节和治疗能力。其次，在体内环境中，遗传因素和骨髓间充质干细胞的自我更新能力无法控制，从而可能产生致瘤性。此外，尽管间充质干细胞具有强大的再生调节潜力，但尚不确定它们是否能在静脉注射后靶向或留在受损部位。有证据表明，由于宿主的清除能力，只有少量MSC到达靶位点。尽管原位注射可以部分解决这些问题，但细胞分化和衰老仍然存在问题，临床效果不容乐观。MSC还被发现可导致和促进各种类型癌症的生长。此外，还有细胞治疗的常见相关风险，如病毒感染和免疫排斥，以及储存和运输问题。

间充质干细胞的大多数治疗作用取决于其旁分泌作用，EVs可以取代其母细胞，这一发现为研究人员提供了重要的研究思路。EVs具有很大的优势：它们不自我复制，在很大程度上避免了致瘤风险；与细胞治疗相比，EVs更安全，作为纳米颗粒，它们还具有生物相容性和低免疫原性，使它们能够穿过血脑屏障等保护性生物屏障；此外，永生化间充质干细胞还可持续分泌EVs，以获得足够的数量；EVs通过其脂质膜结构保护其内部生物分子活性，可在-80°C下长期保存，即使在反复冻融后也不会失活，而且它们具有封装能力，可以装载特定药物并将其运输到靶细胞，如递送mRNA等。

值得注意的是，MSC-EV表达EV表面标记物CD63、CD9和CD81，以及间充质干细胞表面标记物CD44、CD73和CD90。此外，MSC分泌的细胞外囊泡中所含的蛋白质是一种特定的蛋白质亚类，决定了其独特的生物功能。同时，MSC-EVs中封装的mRNA和miRNA形成了其功能的分子基础。因此，MSC-EV通过内部物质传输信息并与靶细胞通信，从而改变靶细胞的活性和功能。在治疗自身免疫性疾病中，发现BM-MSC衍生的EVs通过上调miR-34a靶向抑制细胞周期蛋白I激活的ATM/ATR/p53信号通路，从而抑制RA成纤维细胞样滑膜细胞（RA-FLS），并显著改善体内RA炎症。另一项关于自身免疫性I型糖尿病（T1DM）调节的研究表明，脂肪MSC衍生的EV通过上调Treg细胞、IL-4、IL-10和TGF-β的表达以及下调IL-17和IFN-γ来改善T1DM症状。还有临床研究中脐带血来源的MSC-EVs对T1DM患者胰岛β细胞的影响（NCT02138331）。已有大量临床研究MSC-EVs的免疫调节和再生潜力，评估其在多种疾病患者中的安全性和有效性（表1）。

▼表1 基于MSC-EVs免疫调节和再生潜力的临床试验摘要

MSC-EVs在免疫调节和再生中的应用

基于MSC-EVs与多种靶细胞（包括巨噬细胞、小胶质细胞、软骨细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、神经干细胞（NSC）、神经元、肝星状细胞）之间的细胞通讯，MSC-EVs在免疫调节和组织再生方面的治疗潜力已被报道。这里讨论了MSC-EVs在组织修复和抗纤维化中的分子机制，其中几个miRNA簇及其下游途径已被揭示在骨关节炎、脊髓损伤、皮肤损伤、肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化中发挥重要作用（表2-7）。

支持组织修复

1骨关节炎

骨关节炎（OA）是关节疾病的主要形式，发病机制尚不清楚，表现为疼痛和僵硬，在某些情况下还可导致残疾。MSC-EVs已被证明在OA中具有再生和免疫调节的作用（表2）。

▼表2  细胞外囊泡在骨关节炎中作用的研究

几项研究报道，hBMSC-EVs通过抑制一些促炎途径和因子，增强软骨细胞的增殖和迁移，在OA的治疗中发挥着重要作用。此外，在OA样软骨细胞中，MSC-EVs诱导II型胶原蛋白和蛋白聚糖（软骨细胞标记物）的表达，同时抑制MMP-13和ADAMTS5（分解代谢）和iNOS（炎症标记物）表达。在OA模型中表明MSC-EVs的作用是由于TGFBI mRNA和蛋白质的存在。在同一模型中，骨髓MSC-EVs促进永生化巨噬细胞RAW264.7从M1向M2的转化，降低促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达，并增强IL-10、软骨生成基因、II型胶原和SOX9的表达。在IL-1β存在的情况下，MSC-EVs可以通过增加II型胶原合成和减少MMP-1、MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表达来改善软骨变性。

最近的多研究也检测了miRNA在MSC-EVs中的作用。在滑膜来源的MSC-EVs（SMSC-EVs）中，过度表达miR-140-5p以阻断Wnt5a和Wnt5b，从而通过Wnt信号通路激活YAP，并显著减少细胞外基质（ECM）分泌。缺氧增加了HIF-1α诱导的bMSC EVs中miR-216a-3p的表达，并通过抑制JAK2/STAT3信号通路使JAK2的下调，促进软骨细胞的增殖、迁移和减少细胞凋亡。这些miRNA和MSC-EVs的组合可以作为OA的潜在治疗方法

2脊髓损伤

脊髓损伤（SCI）是在各种致病因素对其结构和功能造成损害后发生的，随之而来的是脊髓功能障碍，包括运动、感觉和反射功能障碍。由于神经成分的再生能力有限，MSC-EVs最近被视为SCI的一种有前途的临床治疗方法（表3）。

▼表3  细胞外囊泡在脊髓损伤中作用的研究

有研究者在动物模型中研究了hBMSC-EV给药，证明抑制凋亡蛋白（Bax）和促炎因子（TNFα和IL 1β），促进抗凋亡蛋白（Bcl-2）、抗炎蛋白（IL 10）和血管生成，还可以改善运动功能。有趣的是，BMSC-EVs介导的周细胞迁移减少与NF-KB P65信号通路的抑制相关，从而削弱血脑屏障（BSCB）。

3皮肤损伤

皮肤损伤很常见，皮肤再生通常伴随着四个过程：炎症、血管生成、新组织形成和重塑（表4）。最近有证据表明，人源的MSC-Evs通过调节相关信号通路，有益于治疗皮肤损伤并加速伤口愈合。

▼表4  细胞外囊泡在皮肤损伤中作用相关的研究

从机制上讲，hADSC-Evs通过下调TNF-α、IL-6、CD14、CD19、CD68和caspase 3，并上调VEGF、CD31、Ki67、PCNA、和AQP3来实现皮肤损伤修复。hBMSC-EVs通过靶向TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad4，增加TGF-β3和Smad7的表达，从而改善疤痕形成并促进伤口愈合。

4抗肝纤维化

肝纤维化是一个病理的生理过程，是指由于各种致病因素导致肝内结缔组织异常增殖，MSC-EVs被认为是修复肝纤维化的一种新的治疗方法（表5），体内注射hBMSC-Exos被证明可有效缓解CCL4诱导的大鼠肝纤维化并恢复肝功能，miRNA在MSC-EVs中的抗纤维化作用已成为CCL4诱导的大鼠肝纤维化研究的热点。脂肪来源的ADSC-EVs中的miRNA 181-5p过表达已被证明下调转录3（STAT3）和Bcl-2，并激活HST-T6细胞中的自噬，同时肝脏中I型胶原、波形蛋白、a-SMA和纤连蛋白显著减少。

▼表5 细胞外囊泡在肝纤维化中作用的研究

5肾脏纤维化

肾纤维化是一个渐进的病理生理过程，在此过程中，肾功能从健康发展到受伤，再发展到损伤，最终丧失功能。越来越多的人使用各种模型研究MSC-EVs治疗肾纤维化（表6）。

▼表6 细胞外囊泡在肾纤维化中作用的研究

在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型中，hUC-MSC-Exos通过酪蛋白激酶1δ（CK1δ）和E3泛素连接酶β-TRCP抑制Yes相关蛋白（YAP），从而改善肾纤维化。还有类似的研究证实hUC-MSC-Exos通过抑制ROS介导的p38 MAPK/ERK信号通路来减轻肾纤维化。乳脂球-表皮生长因子8（MFG-E8）包含在BMSC-EV中，并通过阻断UUO模型中的RhoA/ROCK途径改善肾纤维化。相应地，最近的研究也表明，来自ADSCs的外泌体通过miRNA改善糖尿病肾病（DN）的发展。据报道，在NOD/SCID/IL2RγKO（NSG）小鼠中多次注射HLSC（人肝干细胞）EVs可显著改善肾纤维化和I型胶原的表达。此外，相关基因（Serpina1a、FAS配体、CCL3、TIMP1、MMP3、I型胶原和SNAI1）显著下调，从而减轻DN症状。

6肺纤维化

肺纤维化特征是成纤维细胞增殖和大量细胞外基质积聚，伴有炎症损伤和组织破坏。正常肺泡组织受损，异常修复导致结构异常。特发性肺纤维化（IPF）主要表现为肺纤维化病变，是一种严重的间质性肺病，可导致肺功能的进行性丧失。IPF的死亡率高于大多数肿瘤，被认为是一种肿瘤样疾病，MSC-EVs已成为肺纤维化的有效治疗方法（表7）。

▼表7  细胞外囊泡在肺纤维化中作用的相关研究

BMSC外泌体通过免疫调节发挥其治疗作用，在小鼠模型中，BMSC-Exos已被证明可以抑制M1巨噬细胞的产生和促进M2巨噬细胞的增殖，显著改善高氧（HYRX）诱导的支气管肺单核发育不良（BPD）、肺泡纤维化和肺血管重塑。同样，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，BMSC-Exos已被证明通过调节MΦ表型的整个肺失衡来显著逆转纤维化。此外，UC-MSC Exos调节的Wnt5a/BMP信号通路可增强Wnt5a、Wnt11、BMPR2、BMP4和BMP9的表达，并下调β-catenin、Cyclin D1和TGF-β1的表达，在单核细胞系（MCT）诱导的肺动脉高压（PH）大鼠模型中，MSC-Exos可显著改善肺血管重塑和肺纤维化。此外，MSC-EVs可以通过miRNA表达来逆转肺损伤和肺纤维化。如BMSC-EVs中的miR-186抑制SOX4和Dickkopf-1（Dkk1）的表达，从而有效抑制成纤维细胞的发育并减弱IPF。hPMSC-EVs可以携带miR-214-3p并下调ATM/P53/P21信号传导，从而缓解辐射诱导的肺部炎症和纤维化。还有在LPS诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型，证明MSC-Exos通过转运miR-23a-3p和miR-182-5p来抑制NFκB和Hedgehog通路，从而改善肺损伤和纤维化。

MSC-Evs作为先进疗法的挑战和应用

尽管基于MSC-Ev的治疗作为一种新型的“无细胞”生物治疗产品具有很大的前景，但在临床应用之前仍有许多挑战需要克服。目前，有几个限制因素限制了MSC-Evs的临床应用，包括不同来源的Evs成分的差异，以及缺乏大规模生产的标准操作流程，这两者在很大程度上都取决于Evs来源的质量控制。

不同来源和批次的MSC衍生Evs质量参差不齐

间充质干细胞最常见于骨髓（BMSC）、脂肪（ADSC）、脐带（UCMSC）和其他组织，但很难保证不同来源和不同批次间充质干细胞细胞及其EVs的质量一致性。这严重限制了间充质干细胞及其EVs作为药物的质量控制和管理，并增加了耐药性问题，使得体外和体内功能检测的再现性有限。

在血管生成研究中，比较了BMSC、ADSC和UCMSC衍生的EVs，发现它们可以减少心肌细胞凋亡，促进血管生成，改善心血管功能。值得注意的是，来自ADSCs的EVs刺激心脏保护因子VEGF、bFGF和HGF表达。此外，在两项独立的缺血模型研究中，与ADSC衍生的EVs相比，BMSC衍生的EVs似乎具有更大的血管生成潜力，与对照组相比，内皮细胞数量增加了约4倍。另一项研究表明，来自子宫内膜间充质干细胞的EVs比来自BMSC或ADMSC的EVs导致更高水平的血管生成。

成骨研究中，在两项单独的大鼠颅骨缺损研究中，BMSC-EV治疗使骨体积比对照组增加了四倍，而ADSC-EV使骨体积增加了约1.33倍。另外，BMSC和ADSC衍生的EVs还加速了软骨细胞的增殖、迁移和成骨分化。

EVs的大规模生产受限

为了开发MSC-EVs治疗产品并商业化，需要对原始材料进行质量保证（QA），包括制造MSC时使用的原代细胞。从成人组织大规模生产用于临床试验的EVs仍然存在许多困难，因为专有MSC的培养时间有限，容易老化，并且成本高昂。此外，它们的异质性使得传统的细胞培养在时间和成本方面效率低下。

PSC克服MSC-EVs的大规模生产和质量问题

原始来源的MSCs需要良好、一致和可控的质量，并具有大量增殖和分泌EVs的能力。为了实现这一点，现在已有使用PSC建立了MSC的诱导系统，以克服MSC-EV大规模生产和质量变化的问题。与从传统来源的MSCs相比，来源于相同亲本PSC的MSCs，克服了使用多种来源的MSCs时EV异质性的问题。最近，源自人类多能干细胞（hPSC）的GMP级MSC已用于难治性移植物抗宿主病（GVHD）的临床试验（PRJNA721023，安德森癌症中心）。值得注意的是，hPMSC-EVs的初步治疗效果已在一名皮肤cGVHD患者中报道，静脉注射hPSC-MSC-EVs后，皮肤僵硬和干燥明显改善。基于初步疗效和安全性，启动了一项1期临床研究，以评估BM-MSC衍生EVs在腹部实体器官移植后急性或慢性排斥反应患者中的安全性和有效性（NCT05215288）。hPSC-MSC衍生的EVs可能会大规模促进MSC-EVs的临床应用，因为hPSC-MSC与传统MSC相比具有质量控制和大规模生产优势。

结论和展望

源于MSC的细胞外囊泡在免疫调节和再生的发展中起着关键作用，这些EVs模仿干细胞的作用，通过调节免疫途径、促进效应细胞迁移和增殖以及减少细胞凋亡来发挥强大的功能。迄今为止，已有15项临床试验在ClinicalTrial.gov上注册，但尚未完成。尽管与MSC细胞治疗相比，EVs的免疫反应较低，安全性较高，但其临床应用仍存在挑战。此外，EVs的成功应用取决于低成本的大规模生产，以及回收效率的提高和更准确的表征方法。随着研究的深入和方法学的进步，未来这些挑战可能得到优化或解决，为MSC-EVs在医学治疗中更广泛的应用提供新途径。

END

参考文献：Kou, M., Huang, L., Yang, J. et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool?. Cell Death Dis 13, 580 (2022).

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