肿瘤细胞中肥胖相关蛋白FTO通过mRNA去甲基化促进免疫逃逸
近年来，肿瘤免疫疗法在控制多种癌症进展方面卓有成效，但是获益病人比例低，原因与肿瘤免疫逃逸密切相关。最近有研究发现表观遗传重编程影响肿瘤中免疫细胞浸润和功能，然而多数相关研究聚焦于基因组的表观修饰，转录组的表观遗传修饰对肿瘤免疫逃逸的影响有待研究。
肥胖相关蛋白（FTO, fat mass and obesity-associated protein）因其第一内含子中的多种单核甘酸多态性 (SNP) 与体重增加、肥胖相关而备受关注。近些年研究发现FTO是一种RNA（m6A）去甲基化酶。m6A是真核生物mRNA上常见的一种可逆的转录后表观修饰，通过调控mRNA翻译在细胞代谢、压力应答等生理过程中发挥作用，和肿瘤的发生转移密切相关。
最新研究
肿瘤细胞的FTO缺失可以增强
T细胞肿瘤浸润、抑制肿瘤生长
为了筛选影响肿瘤免疫逃避的基因，作者用一组报道过的基因(CD8A, CD8B, CD8A, CD8B, CD8A, CD8B，GZMA、GZMB和PRF1)来定义细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 评分，分析了TCGA 皮肤黑色素瘤（SKCM）数据集，发现在已知的表观转录组调控因子中FTO表达与CTL评分的负相关性最显著。此外，FTO的表达与CD3D、GZMA、GZMB、TNFRSF18的表达呈负相关。并且这种负相关关系存在于多种肿瘤中。这些分析提示肿瘤中FTO可能对T细胞抑制有重要作用。
为了验证上述关系，作者进行了野生型小鼠和T、B细胞缺陷（Rag全敲除）小鼠荷瘤实验。野生型小鼠中，Fto-Kd（敲低）的肿瘤细胞成瘤受到抑制，但是免疫缺陷小鼠中，对照组和Fto-Kd组肿瘤之间没有差异，这说明肿瘤细胞Fto-Kd导致的肿瘤抑制和适应性免疫应答有关。流式分析野生型小鼠肿瘤中各种免疫细胞的比例，发现对照组和Kd组肿瘤中天然免疫细胞的比例无差异，但是Kd组CD4+和CD8+ T细胞的浸润显著增强并且产生了IFN-γ和GZMB，而对照组几乎不产生这两种细胞因子。MHC 四聚体检测显示，Kd组CD8+ T显著升高。以上结果表明，肿瘤细胞的FTO缺失可以导致CD8+ T细胞浸润和细胞毒性增加。
肿瘤细胞的FTO抑制了CD8+T细胞
的激活和效应状态
CD8+T细胞激活依赖于DC细胞，但是Fto-Kd组和对照组荷瘤小鼠DC数目和活性没有差别。那么FTO是否直接破坏T细胞的肿瘤识别过程呢？
为了检测肿瘤细胞自身FTO对T细胞的影响，作者分别将对照或Fto-Kd肿瘤细胞和CD8+T细胞共培养8 h后，分选CD8+T细胞进行转录组分析，发现Fto-Kd肿瘤细胞共培养的T细胞比与对照细胞共培养的T细胞表现出更强的细胞毒性状态。细胞实验证明Fto-Kd组CD8+T细胞的IFNγ和GZMB产生能力更强，对肿瘤细胞杀伤能力更强。这些结果表明肿瘤细胞自身的FTO抑制了T细胞的激活和免疫应答。
FTO通过促进肿瘤细胞bZIP家族转录
因子和糖酵解达到抑制T细胞的目的
肿瘤细胞自身的FTO如何抑制T细胞功能呢？肿瘤微环境中，肿瘤细胞可以通过竞争性摄取葡萄糖抑制免疫细胞激活。Seahorse检测和同位素标记检测发现，与对照组肿瘤细胞相比，Fto-Kd肿瘤细胞的糖酵解能力显著降低。用寡霉素处理Fto-Kd肿瘤细胞恢复其糖酵解能力然后与CD8+T细胞共培养，发现CD8+T的活化水平受到抑制。
Fto-Kd是如何抑制肿瘤细胞的糖酵解代谢的呢？作者对Fto-Kd和对照肿瘤细胞进行了RNA-seq，发现在Fto-Kd细胞中下调的基因富集在糖酵解途径，同时bZIP家族的转录因子c-Jun、C/EBPβ和JunB表达水平显著下调。在Fto-Kd或2-DG处理（抑制糖酵解）的肿瘤细胞中过表达JunB能抑制T细胞活化。以上结果表明肿瘤细胞中Fto-Kd可能是通过下调bZIP家族转录因子导致T细胞活化。
FTO以m6A依赖的方式上调
bZIP家族转录因子
为了进一步探究FTO影响bZIP家族转录因子表达的机制，作者对Fto-KD组和对照组肿瘤细胞进行了m6A-seq。分析发现，Fto-Kd细胞m6A甲基化峰总数量有一定量的增加，在终止密码子周围明显富集。通过计算每个峰的m6A比率，作者鉴定出667个“m6A增益峰”（包括86.8%的差异甲基化m6A峰）和101个“m6A损失峰”。抑制Fto和m6A增益峰基因表达降低相关。接下来作者选择了83个下调的“m6A增益峰”基因定为Fto-m6A直接调控基因（包括bZIP家族的Jun和cebpb）。GO分析发现这些基因在DNA结合和转录激活相关功能通路上富集。
为了确认JunB和C/EBPβ是否由FTO直接调控，作者通过CRISPR-dCas13b系统靶向降低两者的m6A甲基化，观察到肿瘤细胞中Junb和Cebpb表达上调、糖酵解相关基因表达上调，而共培养的T细胞的IFN-γ和GZMB的分泌能力减弱。这表明，FTO通过直接去甲基化Junb和Cebpb调节下游糖酵解基因最终抑制T细胞功能。
Dac51是一种潜在的更有效的FTO抑制剂
FTO抑制剂已被证明具有显著的抗肿瘤作用。作者优化了其之前报导过的FTO抑制剂获得了Dac51。细胞热迁移试验(CETSAs)表明在肿瘤细胞中Dac51能稳定FTO蛋白的热变性，这表明FTO是抑制剂Dac51在细胞中的直接靶点。Dac51处理后的肿瘤细胞mRNA的点杂交检测也证实m6A丰度升高。对Dac51处理的肿瘤细胞的m6A-seq数据进行分析，发现大多数m6A标记基因上的m6A修饰增加，包括Jun和Cebpb。Dac51处理降低Jun、Cebpb和Junb的mRNA和蛋白水平；Dac51处理和Fto敲除对糖酵解代谢的抑制水平相当。
以上结果表明，Dac51可以作为一种有效的FTO抑制剂，通过抑制FTO介导的Jun和Cebpb转录本的去甲基化，抑制肿瘤细胞的糖酵解能力。
Dac51治疗增加了T细胞浸润，
并能与PD-L1抗体协同作用
为了确定Dac51是否具有和Fto-Kd类似的抗肿瘤作用，作者用Dac51预处理的B16肿瘤细胞和T细胞共培养，共培养后的T细胞中细胞因子的释放增强，细胞毒性提高。用Dac51处理患者来源类器官(PDOs)得到了与小鼠模型一致的结果，Dac51处理后PDOs的C-jun、C/EBPb和JunB的表达水平降低，糖酵解相关基因表达水平降低。更令人振奋的是，Dac51对T细胞、成纤维细胞等毒性非常微弱。
用Dac51处理肿瘤细胞Fto-Kd组和对照组的荷瘤小鼠发现，Dac51处理和Fto-Kd效果一致，可以有效抑制肿瘤在体内的生长。对脾脏和肿瘤引流淋巴结中的T细胞检测显示，Dac51治疗增强了T细胞中IFN-γ的释放。而Dac51在Rag2缺失小鼠中则没有效果。这表明Dac51介导的FTO阻断以T细胞依赖的方式抑制肿瘤生长。
PD-L1联合给药实验证明，与单药治疗组相比，联合治疗组肿瘤生长速度显著减慢，总生存期明显延长。联合治疗还能激活长寿命记忆T细胞应答，使用比初始接种剂量多10倍的肿瘤细胞对幸存小鼠再荷瘤后，所有小鼠的肿瘤完全消失。
总 结
本文揭示了表观转录组修饰调控肿瘤细胞免疫逃逸的新机制，发现FTO可以通过下调bZIP家族转录因子的m6A修饰来促进肿瘤细胞糖酵解基因表达和糖酵解过程，从而降低T细胞的肿瘤浸润程度和细胞杀伤能力。同时，本文优化得到了FTO的小分子抑制剂Dac51能够促进肿瘤中T细胞浸润和细胞杀伤能力，并显著增强PD-L1的疗效。
文/阿司匹林 SHFT
责编/Jane
原文链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413121001674?via%3Dihub
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