【深度好文】CRISPR Cas发展史、机制、分类及应用
聚焦CRISPR/Cas系统
2022/6/7
CRISPR/Cas基因编辑系统，是基因编辑领域革命性的发现。以临床基因检测为例，检测不是目的，后续的治疗干预、形成诊疗闭环、让受检者获益才是价值所在。强大的基因编辑系统的出现，打通了基因存、读、写的最后一个环节，让人类之手无限接近于上帝之手，让既往无法治愈的疾病的治愈成为可能，并且已经有成功案例。此外，CRISPR/Cas系统在核酸快检方向，也展现出较大的应用价值。
这是基因江湖的第一篇读者投稿，来源 迅识生物 团队，专注于CRISPR/Cas等新兴分子生物学技术的原创开发、即时诊断领域产品的研发和应用。纯干货知识分享，货真价实，不夹带私货，请读者放心食用（文末附CRISPR参考文献合集下载）。同类纯技术、知识类文章，可以联系笔者，无偿发文，以飨读者。同时，为鼓励原创知识分享，文末会开放投稿作者、团队介绍。
文章目录
1.CRISPR/Cas发展史
2.CRISPR/Cas免疫防御机制
3.CRISPR/Cas系统分类
4.CRISPR/Cas系统应用
5.参考文献下载链接
CRISPR/Cas系统包括CRISPR序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和临近的Cas基因（CRISPR-associated），该系统可以精准识别并切断外源核酸，沉默外源基因的表达，保持自身遗传系统的稳定，是原核生物抵抗外源遗传物质（如噬菌体和外源质粒）入侵的一种防御手段。正是基于这种精确的靶向功能，通过简单的设计，RNA可以精准定位不同的基因靶点，因此可以高效率的对目标基因进行编辑和检测，展现出了巨大的应用前景。
Natural mechanism of the CRISPR/Cas system
CRISPR/Cas作为基因编辑系统被应用最早开始于2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier的发现，两位教授因此获得了2020年诺贝尔化学奖，再一次将CRISPR技术推向了新的研究热潮。
Nobel Prize in chemistry 2020
作为一项新兴的基因工具，CRISPR/Cas系统已被开发成为一种高效的基因编辑工具，受到众多科学家的广泛关注，其发展也经历了20余年的时间，凝聚着科学家的坚持和持之以恒的努力。
一、CRISPR发展史
1987年，日本大阪大学(Osaka University)的科研人员在对大肠杆菌中碱性磷酸酶同工酶基因进行鉴定时，意外的发现了一段重复的DNA序列，即包含24个核苷酸的5个同向重复序列，但并不清楚该段序列的生物学意义和CRISPR/Cas的关联。1993年，在研究古细菌时，CRISPR首次被证实，随后越来越多的类似序列被发现和确认。
20世纪末，研究人员通过比对发现，这种重复序列存在于20多种细菌及古生菌中，并将其命名为短规律性间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，而后又将上述重复的DNA序列修订为CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，临近的基因称为Cas基因（CRISPR associated基因）。
2007年，Horvath研究组认为CRISPR及cas基因一起为嗜热链球菌提供了对噬菌体的抗性作用，同时其特异性取决于CRISPR中的间隔区序列，这是CRISPR的免疫功能首次在细菌中得到实验证实，后续的研究又证明了前间隔序列临近基序（PAM）基因能够为该系统发挥功能提供识别作用。
为了进一步了解这个免疫系统，Charpentier在对化脓性链球菌进行研究期间，发现CRISPR/Cas9作为细菌的免疫系统，可以切割病毒的DNA以抵抗病毒入侵。从此，细菌获得性免疫系统CRISPR/Cas作用机制被基本阐明。
随着研究的深入，CRISPR和Cas蛋白之间的进化关系也逐步得到了更深的了解，形成了以Cas1和Cas2基因为核心构成的三种不同类型的CRISPR/Cas系统，其中，I型和III型系统需要多种蛋白共同参与才可以发挥作用，而II型系统就简单很多，只需要一种标志性的Cas蛋白即Cas9便可完成DNA识别和剪切，正是由于CRISPR-Cas9系统这种简洁、易操作的特点，为其进一步的应用奠定了坚实基础。
Structure of CRISPR/Cas
2012年，Charpentier和Doudna在体外重现了基因剪刀CRISPR/Cas9，能够在指定位点切割 DNA。紧接着在2013年，麻省理工张峰团队率先证实CRISPR/Cas系统同样能够在真核细胞中起作用。
随着研究的继续深入，CRISPR/Cas9也暴露了缺陷和局限性，例如严重的脱靶效应，随后通过不断的努力，科学界逐步降低了CRISPR/Cas9系统应用中的脱靶效应等风险，更有助于该技术在疾病模型建立、抗癌药物研制、干细胞治疗等生物和医学等领域的应用。世界各国的研究人员也纷纷利用该技术，探索了在不同领域的基因编辑应用。如利用CRISPR基因编辑技术对人淋巴细胞进行改造，从而使得这些细胞能够攻击人T细胞癌，为肿瘤的新疗法提供可能性。
CRISPR gene-editing
随着CRISPR技术的进一步发展，一些新的Cas蛋白（Cas12/Cas13/Cas14）不断被发现，它们区别于Cas9，即在识别某种序列之后，会同时激活其切割能力，切割体系中的DNA或RNA。利用其快速、特异性强等特点，科学界也在开发新的诊断工具，特别是CRISPR系统在病原体、肿瘤基因诊断领域的快速检测应用上。
最初发现的有两种：
（a）SHERLOCK系统：Cas13a能够在与靶基因结合后，激活其切割活性，继续切割系统中带有荧光基团的RNA报告分子。当报告分子被切割时，通过检测发出的荧光，实现检测目的；
（b）DETECTR系统：类似的原理，采用Cas12a实现非特异性ssDNA的检测。
Nucleic acid detection platform of SHERLOCK
同时，其他国家的科学家也在陆续研究和开发新的CRISPR/Cas系统。2019年，中国科学院动物研究所李伟团队发现Cas12b系统在激活之后具有任意切割ssDNA的特性，并成功开发出 CDetection（Cas12b-mediated DNA detection）技术，同样实现了微量DNA的简便快速检测。
Cas12b-mediated DNA detection
自新冠疫情爆发后，基于CRISPR系统的SARS-CoV-2核酸检测试剂也已上市，如基于SHERLOCK、DETECTR等CRISPR/Cas系统的试剂盒均已获得美国FDA的紧急授权使用，这是FDA首次授权使用CRISPR技术进行传染病检测。国内企业也相继开发了基于CRISPR/Cas系统的新冠核酸检测产品，如杭州众测和上海伯杰公司也于近期均注册获批了新冠核酸检测试剂。
最后，总结一下CRISPR的发展历程如下：
Timeline of the CRISPR–Cas system with important milestones
尽管CRISPR技术在人类基因组编辑和诊断中的应用还需要更加全面的研究，但已经在基因编辑和诊断的应用中显示出了强大的能力。随着技术的不断发展，CRISPR系统会被广泛应用于感染性、遗传性疾病和肿瘤的诊疗以及农作物育种等方面，以解决不同的需求。
二、CRISPR/Cas免疫防御机制
CRISPR/Cas系统之所以能够在基因编辑及诊断领域广泛应用，主要基于不同功能的Cas蛋白能够在特定位点触发核酸的断裂，这与CRISPR/Cas系统的免疫防御机制是一致的。CRISPR/Cas系统进行免疫防御主要分为3个阶段：适应(Adaptation )、表达(Expression)、干扰(Interference)。
首次入侵的外源DNA的前间隔序列被古菌或细菌中的Cas蛋白获取，并作为间隔序列插入CRISPR中的两段重复序列之间，即为适应阶段。当外源DNA再次入侵时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA，则为表达阶段。最后的干扰阶段，成熟的crRNA与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，从而降解病毒的核酸，达到免疫防御的目的。
利用这种原理，再加上被切断的双链DNA能够激活细胞的非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组 (HR) 两种修复机制，从而实现基因的敲除、插入或修饰，也就实现了基因编辑的目的。
CRISPR/Cas系统免疫防御机制
三、CRISPR/Cas系统分类
在免疫防御过程中，不同类型的Cas蛋白在CRISPR系统适应、表达、干扰等作用阶段发挥的功能各异。根据Cas蛋白的组成不同和效应复合物的性质，CRISPR/Cas系统分为2大类，即Class1和Class2。
其中，Class1系统的效应复合物由4-7个Cas蛋白亚基组成，该类别的共同特征是利用多个Cas蛋白效应复合物实现干扰靶标核酸；而Class2系统的效应复合物则是单个多结构域蛋白，如Cas9、Cas12等。另外，根据剪切模块的序列和功能特征，以及辅助模块的构成，Class1又分为3种类型即TypeⅠ、Ⅲ、Ⅳ，Class2分为TypeⅡ、Ⅴ、Ⅵ，详细信息如下图所示。
CRISPR/Cas 系统架构及功能模块
从上图可以看出，
（1）在适应过程中，CRISPR/Cas系统获得新的免疫记忆主要通过Cas1和Cas2蛋白的参与；
（2）各类型的CRISPR/Cas系统在表达和干扰阶段存在较大差异，在crRNA成熟过程中，Cas6同源蛋白加工Class1系统中的crRNA，而在Ⅱ型CRISPR系统中则由Cas9和RNase Ⅲ负责加工crRNA，V型和VI型CRISPR系统中分别由Cas12和Cas13加工crRNA；
（3）在与靶DNA相结合过程中，Class1系统中crRNA与多个蛋白组成复合物与靶DNA相结合，而Class2 系统中crRNA与单个蛋白组成复合物发挥作用。
CRISPR/Cas系统的进化分类由Makarova等人在2011年第一次进行了整理，随后该分类于2015年和2020年分别进行了更新。在2020年最新的分类规则中，Class 1系统较2015年增加了4个亚型III-E、III-F、IV-B和IV-C，目前共16种亚型。与Class 1相比，Class 2系统只需要一个RNA引导的Cas核酸酶就能够完成对靶点的切割，使用简单、方便，有效的驱动了研究者在此类中寻找潜在的新基因组编辑和诊断工具。自2015年以来，该系统从2个类型和4个亚型，扩展到3个类型和17个亚型，这些新发现包括多种V型和VI型系统。
新的CRISPR/Cas 系统分类示意图-Class1
新的CRISPR/Cas 系统分类示意图-Class2
注：在Class 2系统中，某些编码基因下的Cas蛋白标注了两种不同的名称，如Cas12e（CasX），Cas12d（CasY），Cas12f1（Cas14a）等，这主要是由于不同的命名系统差异导致，可能与一些相关的专利或者命名权争议有关。
四、CRISPR/Cas系统应用
在CRISPR发展史中，我们对该系统的应用做了简单的介绍，因此本部分重点关注应用研究的进展。由于CRISPR/Cas系统的靶点特异性结合和切割能力，以及仅通过改变gRNA的序列就可以定位到任何基因位点 。
目前，在基因编辑领域，CRISPR/Cas9应用最为广泛。该系统由crRNA与tracrRNA通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后借助crRNA与靶DNA位点进行碱基配对，通过这种方式，嵌合RNA就能够引导Cas9结合到靶位点上并进行切割，防止外来遗传物质入侵。
CRISPR/Cas9作用机制
CRISPR/Cas9系统构成简单、特异性优良、切割效率高，广泛用于编辑各种生物体内的基因。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术已经在一系列基因治疗领域展现出了巨大的应用前景，如血液病、遗传疾病、肿瘤等。与Cas9 相比，Cas12a（Cpf1）只需一个协助RNA分子，酶分子量比Cas9小，进入细胞更容易，选择灵活性更大，且会产生黏性末端，便于新DNA序列插入，因此给基因编辑提供了更多的可能性。
在产业化开发领域，越来越多的公司专注开发基于CRISPR/Cas系统的基因编辑治疗药物，如Editas Medicine和CRISPR Therapeutics，前者由华人科学家张锋领导，后者的联合创始人是Emmanuelle Charpentier。值得一提的是，CRISPR Therapeutics与合作伙伴Vertex制药公司在2019年04月宣布，美国食品和药物管理局（FDA）授予公司基因编辑疗法CTX001用于治疗输血依赖性β地中海贫血（TDT）的快速通道资格。除此之外，还有很多不同治疗方向的药物处在研究阶段（部分如下表所示）。通过对已有基因编辑工具的优化以及新工具的发现，不断提高精准度和效率，期望可以为临床疾病的治疗提供新的模式。
基于CRISPR/Cas系统基因治疗的临床试验
（来源于https://clinicaltrials.gov/ct2/home; https://crisprmedicinenews.com）
在诊断方面，CRISPR/Cas系统中存在一些特殊的功能蛋白，如Cas12、Cas13等，这些酶在gRNA的引导下，能够在识别目标序列后启动靶向切割活性，同时还能非特异性切割体系内的DNA或RNA分子（也称为“反式切割”）。如果在反应体系中加入带有荧光基团的报告核酸分子，利用反式切割活性，使报告分子释放出荧光信号，即可提示目标核酸分子的存在，这些构成了CRISPR/Cas 系统诊断技术的基础。
不同CRISPR/Cas 系统的切割活性
Cas12与Cas13参数比较
目前，CRISPR/Cas系统在不同的诊断领域也都有较多的进展，如病原检测、SNP检测等。部分信息如下：
基于CRISPR/Cas系统的核酸诊断方法
相信随着对CRISPR/Cas系统的进一步认识，基于该技术的基因编辑方法必将成为人类治疗疾病的一种常规手段，其治疗方式的个体化、最优化原则将为人类健康选择创造更多机遇，同时由于其高灵敏度和特异性，CRISPR/Cas诊断技术在病原体及耐药性基因检测、癌症突变分析和液体活检等不同领域的研究和应用将也会更加深入广泛。
*文章版权归属迅识生物团队，参考文献见文末附件。
*为感谢迅识生物团队的知识分享，特介绍一下这个专业、有趣的团队：
更多知识分享：
加笔者微信，交个朋友