基因检测在疾病确诊、家系遗传模式分析与再生育计划中的重要作用
1、基因检测涉及什么？
如果患者/家长决定继续进行测试，则会发生以下过程：
在讨论测试的风险和好处后获得同意，并提供表达任何疑虑或疑问的机会
从患者身上采集血液样本（有时是唾液样本），也可能从其他家庭成员身上采集血液样本
发送样品进行测试和分析（可能需要几个月的时间来处理）
根据临床结果（您的症状和医生的检查结果）解释遗传数据，并评估已确定的遗传变化作为病情根本原因的可能性
进行基因检测通常出于以下原因：
诊断测试：对之前没有个人/家族结果的患者进行分子诊断
确认测试：确认具有已知家族变异的受影响患者的分子诊断或确认之前通过研究参与获得的结果
携带者检测：对通常健康但可能是隐性或 X 连锁遗传病或非外显性显性遗传病携带者进行检测 。它通常是为了指导有生育 受影响孩子风险的人的计划生育。根据某些遗传等位基因的特定人群频率以及是否存在近亲结婚，某些隐性病症的携带者可能更有可能影响孩子
家族隔离分析：测试家庭成员以评估遗传变异的家族内传播。例如， 通过检测父母或孩子，确认常染色体隐性遗传病患者的突变等位基因为反式；通过检测其他受影响和未受影响的家庭成员来确认常染色体显性遗传条件下不确定的无意义变异的致病性
预测性检测：识别受影响患者的无症状家庭成员，他们本身也有患上这种疾病的风险
随着技术的进步和对人类 DNA 的了解不断加深，基因检测现在变得更加广泛和准确，以多种方式使患者受益。这些包括：
确认特定遗传疾病的诊断：这种疾病有时也可能影响其他器官，需要其他专家的意见，或者有既定的治疗方法（例如， 针对RPE65基因突变引起的视网膜变性的基因治疗，具有双等位基因RPE65突变的患者现在可以接受一种名为voretigene neparvovec (Luxturna)的视网膜下基因疗法的治疗 ）
确定特定病症的预后：一些患者可能存在与全身性疾病相关的变异，需要其他相关专业的投入，这反过来可能会提高预期寿命和/或生活质量
遗传模式：确认其他家庭成员和后代的遗传模式和复发风险
确定携带者的亲属：与患者具有相同基因突变但没有表现出任何症状的人，他们可以将这种疾病遗传给后代。例如，患有外显率降低的常染色体显性遗传疾病的患者或患有X连锁遗传疾病的高危女性携带者
协助计划生育：可以产前诊断与生育辅助
科研好处：为参与新疗法的临床试验铺平道路，为新基因或特定基因突变的发现将为未来的诊断和临床试验提供信息的研究做出贡献
4、基因检测的局限性
尽管基因检测有很多好处，但患者在进行检测之前仍应了解一些限制。这些包括：
信息有限：有时，阳性结果无法预测一个人是否会出现症状、症状有多严重或疾病是否会随着时间的推移而进展；需要更多的研究来建立基因型与表型的相关性
与遗传结果相关的情绪影响：包括压力、悲伤、焦虑和内疚（父母可能觉得他们对孩子的诊断负有责任）
造成家庭内部紧张：因为结果可能会泄露除接受检测者之外的其他家庭成员的信息，例如X连锁遗传病，丈夫会埋怨妻子携带这种基因导致儿子发病，妻子也会因为这些情绪导致压力与内疚情绪。
生育计划可能会受到遗传结果的影响：生育费用提高与生育担忧会增加
就业或保险：这种情况可能存在基因歧视的担忧
病情的管理：不一定会随着遗传结果而改变，因为有的疾病目前可能没有任何特定的治疗策略可用
模糊性：由于个体之间自然发生的遗传变异（称为多态性），有时很难判断先前与任何疾病无关的已识别基因突变是自然多态性还是新的致病突变
意义不明的变异 (VUS)：根据将变异分为5种不同的类别：致病性、可能致病性、致病性变异意义不明，可能是良性且良性的。如果不满足将其分类为其他类别的标准，或者良性和致病性的标准相互矛盾，则将变体称为VUS。通常需要分离分析来帮助确认所识别的变异是否与患者的表型有关
5、基因检测的潜在伦理问题
儿童的症状前/预测性检测：家长可能想知道受影响儿童的临床上未受影响的兄弟姐妹是否有将来患上相同病症的风险。如果父母决定代表未受影响的孩子进行测试，特别是在没有有效治疗/症状通常发生在成年期的情况下（剥夺了孩子做出决定的自主权），可能会出现道德问题。儿童的最大利益应该是进行预测性基因测试或披露现有数据集的预测结果的主要原因。因此不主张对无症状的健康儿童进行检测，除非他们有可用的治疗方法，或者是需要提前疾病管理的并且发病风险很高的疾病。最好建议，如果他们选择并且担心计划生育，可以在成年后进行测试
成人症状前/预测性检测：无症状/轻度受影响的个体如果检测结果呈阳性，可能会经历不必要的焦虑
家庭影响：患者的受影响亲属可能会受到家庭成员的压力，要求进行基因检测，而不是做出明智的自主决定
意外的亲子关系问题：家庭关系可能会造成家庭成员之间的紧张关系
意外的偶然发现：全基因组测序的结果可能会揭示与单独疾病相关的突变，这可能会给患者带来严重的痛苦，并需要其他相关专家的评估
可见基因检测是疾病确诊过程中很重要的利器，但是有时候会过渡检测（例如良性携带、晚发型患者），会导致患者焦虑，所以患者拿到基因报告的时候要多咨询遗传医生，然后每个人都会携带很多基因突变，这些突变很多是良性携带不发病/无症状，也有的是晚年会突变发病，当然提前预知这些异常突变，对患者未来疾病的管理与生育风险评估是有很大的好处。
靶向基因组（NGS 的一部分）和现在很少使用的桑格测序是分子分析的主要途径。由于拷贝数变异（CNV） ，细胞遗传学检测可能更适合综合症。
基因类型具体内容可以参考往期文章：基因检测测序：全基因组(WGS)、全外显子组 (WES)、新一代测序 (NGS）、mRNA 测序 (RNA-Seq)
1、 桑格测序
这种方法最早由英国科学家Fred Sanger于 1977 年开发，使用链终止技术对DNA进行测序。桑格测序的原理可以概括如下：
DNA分解成单链
以引物为模板，通过DNA聚合酶合成新的互补核苷酸，形成互补链
该链继续延伸，直到双脱氧核苷酸（链终止核苷酸）添加到链上，形成片段
双脱氧核苷酸根据其携带的核苷酸（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）用不同颜色的染料标记
这个过程重复多次，产生不同长度的片段
用毛细管凝胶电泳分析所得片段；最短的片段将位于最低车道
DNA 序列根据检测到的有色染料一次构建一个核苷酸
它能够对最多500个碱基的小DNA区域（单个外显子/基因）进行详细测序。
桑格测序的常见适应症是：
临床诊断的分子确认（适用于主要由单基因引起的病症，例如PAX6突变导致的无虹膜 ）
对具有已知家族变异的患者进行分子确认
当可获得受影响和未受影响家庭成员的样本时进行隔离分析
验证通过 NGS 技术鉴定的遗传变异
突变“热点”（DNA 中极易发生突变的区域）分析
桑格测序的主要优点是：
由于仅捕获单个DNA区域，因此可获得高质量的测序数据，被认为是测序的黄金标准
更快的周转时间（可能因实验室而异）
如果仅对单个基因/DNA 区域进行测序，则成本更低
桑格测序的主要局限性是：
诊断遗传异质性疾病（例如遗传性视网膜营养不良）效率低且成本高
无法检测大的 CNV
无法识别新的致病基因
2、下一代测序（NGS）
NGS能够同时对多个靶标进行并行测序（大规模并行测序技术），使其成为研究遗传异质性疾病的理想主要工具。商业上有多种NGS平台，每种平台都采用不同的测序技术和技术。
NGS的工作原理可简单概括如下：
基因组被分解为多个短DNA片段（称为“读取”）
生成的片段的多个测序反应同时发生（并行测序）
然后使用生物信息学软件根据“参考基因组序列”对测序片段进行比对
识别比对的 DNA 序列和参考基因组之间的差异（变体调用）
已识别的变体（多达数百万个）经过质量过滤，并使用来自多种资源（基因组测序数据库、出版物、生物信息过滤器、预测算法等）的证据进行注释，以分离出可能对蛋白质功能和相关蛋白产生致病作用的变体，与正在研究的表型
临床科学家对每个分离的变异进行分析，以确定其引起所研究表型的可能性
检测到的变异的致病性根据标准化分类系统进行报告：致病性（5级）、可能致病性（4级）、意义不明的变异（3级）、可能良性（2级）和良性（1 级）
有多种 NGS 选项可供选择：
靶向基因panel
全外显子组测序
全基因组测序
所有三个选项根据用于选择和富集 DNA 中感兴趣区域的捕获方法而有所不同。
2.1 靶向基因panel
这些面板经过定制设计，重点关注 与特定临床表型相关的基因的特定区域（外显子 和侧翼内含子区域）。这通常是遗传性眼病的主要筛查方法，因为可以同时对大量已知致病基因进行测序，从而最大限度地提高通过单次测试识别致病变异的机会。
这种方法的主要优点是：
大规模测序经济有效且高效（遗传异质性疾病的理想选择）
测序区域的读取深度（基因组中给定核苷酸的读取次数）更大，从而增加检测新颖和罕见变异的可能性
更少的计算和生物信息处理，这意味着需要更少的存储空间
所识别的变异对于正在研究的临床表型更具特异性
该方法的主要局限性是：
无法识别新的致病基因
如果不更新panel，最近发现的新基因/变异将不会被测序
如果断点位于覆盖区域之外，则CNV检测效果不佳
2.2 全外显子组测序(WES)
人类基因组中已知蛋白质编码基因的所有外显子和侧翼内含子均使用该技术进行测序。
外显子组包含编码蛋白质的基因，仅占基因组的1.5%-2.0%，即大约30兆碱基(Mb)。剩余的非外显子区域包括内含子，以及控制基因功能其他方面(如剪接和基因表达水平)的调控序列。
85%以上的已知致病突变是在外显子中发现，因此某些临床情况宜采用外显子组测序。与全基因组测序相比，该方法可大幅降低成本和数据存储要求。外显子组测序还可简化临床报告，因为大多数情况下更容易解读外显子变异的意义。
外显子组测序相对于全基因组测序的主要缺点是，外显子组测序可能遗漏基因组非编码区的致病性变异。因此，如果初始外显子组测序无法诊断，某些情况下可考虑全基因组测序。
WES的主要优点是：
识别新致病基因的能力
适合既往阴性面板研究的患者/具有复杂表型但没有确定临床诊断的患者
比全基因组测序成本更低
WES 的主要局限性是：
深层内含子和基因间变异未测序
不全面代表包括 CNV 在内的基因组结构变异
先前未被识别编码蛋白质的DNA区域将不会被测序
产生大量数据，需要充足的计算机处理能力和存储空间
2.3 全基因组测序（WGS）
该技术对整个基因组的编码区和非编码区（大约 30 亿个核苷酸和 20,000 多个基因）进行测序。成本高于更小范围的测序，因为全基因组相当于约3.3×109个碱基，即3.3千兆碱基(gigabase, Gb)。随着成本降低以及获得更多关于非编码DNA在人类疾病中作用的信息，全基因组测序可能比外显子测序更可取。此外，全基因组测序可用于检测通常只能由阵列比较基因组杂交(aCGH)检测的缺失和重复，因此可能减少对其他补充检测的需求。
WGS 的主要优点是：
能够检测深层内含子、基因间和结构变异，包括 CNV
识别新致病基因的能力
适用于无法通过面板和/或 WES 检测进行分子诊断的患者
WGS 的主要局限性是：
比 WES 和靶向基因 panel 的成本更高
数据解释更复杂
产生大量数据，需要充足的计算机处理能力和存储空间（超过WES）
2.4 靶向基因检测套餐
基因突变检测套餐可提供有限基因(通常10-200个基因)的序列数据。靶向基因检测套餐适用于需要对多个基因测序以做出诊断的情况，如孟德尔遗传疾病，如果使用传统的Sanger测序，则候选基因数量太多。例如，靶向基因检测套餐可用于确定遗传性早发和/或家族性非综合征性听力受损的遗传基础。潜在病因包括60多个基因的致病性变异，使用传统测序方法对所有这些基因逐个筛查并不现实。基因突变检测套餐越来越大(例如，>1000个基因)，尤其是用于共济失调和孤独症谱系障碍等神经系统疾病时。
靶向基因检测套餐可能优于外显子组测序，因为与全外显子组测序相比，其成本低得多、不易发现与所评估疾病无关的意义未明的变异(VUS)且覆盖深度(一个DNA序列区独立测序的次数)更大。在实践中，覆盖深度表明DNA序列被“校对”的次数。覆盖深度有助于区别真正的单核苷酸多态性(SNP)或基因组变异与测序过程中引入的错误。随着成本下降，以及这些基因检测套餐提供了足够广泛的基因网络来检测多种疾病，靶向基因检测套餐的应用相对于Sanger测序不断增加。
3、三代测序
第三代测序也称长读长测序，使用类似于NGS的平行测序，用单个DNA分子而非扩增DNA作为模板。因此，三代测序可能消除实验室在DNA扩增过程中引入的DNA序列错误。
第三代方法正在研发中，通常还不能用于临床。这种方法的技术准确性已接近短读长技术，短读长技术用于NGS，是临床NGS的金标准。三代测序可对基因组中某些最困难的区域进行测序(鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的比例很高，该比例称为“GC含量”，因此为困难区域)，以及更好地分析基因组的结构变异
4、细胞遗传学检测
细胞遗传学检测用于检测染色体异常/CNV 或验证通过 NGS 技术鉴定的 CNV。常见的细胞遗传学检测方法有：
基于微阵列的比较基因组杂交（阵列-CGH）
核型分析
荧光原位杂交 (FISH)
定性荧光聚合酶链反应
4.1 阵列-CGH
Array-CGH 通过将测试样本与用不同颜色标记的参考基因组进行比较来检测 CNV。它可以检测100,000个碱基对 (100 kilobase [kb]) 到 5,000,000个碱基对 (5 Mb) 之间的异常，并且对患有综合征相关眼部疾病的患者具有很高的检出率。array-CGH 的主要局限性是它无法检测平衡染色体重排（导致染色体材料没有净损失/增加），例如倒位 或平衡易位。
4.2 荧光原位杂交
FISH技术可用于计数和定位染色体的大片段。该技术大幅提高了染色体分析的敏感性、特异性和分辨率。FISH可以用于有丝分裂中期的染色体和间期的细胞核；间期FISH可在石蜡包埋的组织上进行。
FISH探针会在与之杂交的染色体上产生荧光斑点，故每对染色体(或染色体区域)就会产生2个斑点。这些双点有时会融合形成一个信号。如果待检区域所在的染色体在细胞中为单体，则每个细胞核上将只有单个斑点；而染色体为三体时则会显示为3个斑点。
FISH也可在改进后用于分析间期细胞核。
该技术的优点包括：
●FISH技术的分辨率远高于传统的染色体显带技术，因为FISH可分辨长度为2Mb的序列，而染色体显带技术为6Mb。
●可用于检测分裂期(中期)和非分裂期(间期)的细胞。
●该方案的技术层面相当简单。
●使用多个探针杂交可以检测易位产物，例如检测CML患者的t(9;22)易位形成的BCR-ABL1融合基因。
●FISH可以识别多种染色体结构异常，包括缺失、重复、非整倍体及是否存在衍生(结构重排)染色体。
●FISH可用于监测骨髓移植患者的复发或残留病变。
该技术的缺点包括：
●不能检测小的突变，包括小的缺失和插入，以及点突变。
●由于探针只能检测到染色体的某位点或特定区域的存在与否，而不能检测其来源，故会漏检单亲二体型(UPD)，即患者的某对同源染色体遗传自同一亲代。
●由于探针只能检测染色体上是否存在特定序列，而不是其在染色体上的准确位置，故会漏检染色体倒位。
●目前，并非针对所有染色体区域的探针都有商售。
●为了做出准确诊断，临床医生必须选择正确的FISH探针。
间期FISH：当不能获得分裂期细胞时(例如，细胞完全分化或组织已经固定并用石蜡包埋)，则采用间期FISH。该技术也提高了FISH探针的分辨率。
4.3核型分析
它是对生物体的所有染色体进行配对和排序的过程，给出个体染色体结构的总体快照。它是检测染色体异常的最常规方法之一。与 array-CGH 不同，除了 CNV 之外，它还可以检测平衡重排，包括倒位和平衡易位。然而，它只能检测最小大小为 5-10 Mb 的大型染色体异常。
5、解读
NGS数据的临床解读比传统测序更难，因为NGS提供的数据涉及多个基因“变异"，其中许多变异在意料之外且位于非关注基因，预后意义不明。
NGS的结果通常报告如下：
致病性：致病性变异是有相关疾病的患者之前报告的变异，和/或根据临床前研究强烈怀疑有致病性的变异。
可能致病性：可能致病性变异是指具有可能与疾病发病机制有关的序列特征的变异，但没有致病性的确凿证据。
可能良性：可能良性变异是指医学文献中可能有支持致病性的弱数据，但大多数证据表明该变异的影响是良性。
良性：良性结果是指预计不会改变基因表达或功能的遗传变异。
临床意义未明：VUS也称“临床意义不明的发现”，具有一些提示可能的功能影响的特征，但没有足够证据表明有致病性或良性作用。
临床医生和患者必须意识到，得到VUS结果的可能性相当高，因为许多变异的临床意义不明。例如，一篇关于外显子组测序的文章指出，一次普通测序可检出超过300万个变异，其中15%-20%可能临床意义不明。因此，如果临床医生要开具NGS检测并向患者提供NGS的结果，则应接受适当培训以了解如何告知这些问题。
临床NGS实验室通常会对致病性或良性变异的解读达成一致。而对其他类别的解读则在实验室之间有显著差异。随着任何变异的数据都越来越多(尤其是临床结局数据)，各实验室解读结果的一致性也会逐渐增加。
以下报告阐明了解读NGS数据面临的困难：
●对无其他健康问题的腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth, CMT)患者进行全基因组序列分析发现，除了有助于识别导致CMT的突变，还发现了159个与已知疾病(或性状)有关的突变，包括33个与癌症有关的变异，48个与复杂疾病有关的变异，以及21个与孟德尔遗传(单基因遗传)疾病有关的变异。此类疾病大多没有明显家族史，因此尚不清楚如何解读和处理这些变异。但随着新数据的出现，纵向随访患者可能有帮助。
●对于一名有冠状动脉疾病家族史、27名亲属中有1例猝死的40岁健康男性，全基因组序列分析发现了许多与罕见和常见疾病有关的变异，包括先前与心脏性猝死有关的3种突变。将预测模型用于32种疾病，概率结果表明发生肥胖、心肌梗死(概率从检测前的2.0%增至检测后的8.9%)、2型糖尿病(概率从27%增至54%)、前列腺癌(概率从16%增至23%)和抑郁的风险大幅增加，而发生阿尔茨海默病的风险降低(概率从9%降至1%)。基于这些结果，以及患者有明显的动脉粥样硬化家族史，医生建议开始降脂治疗，尽管根据血脂情况现有指南并不推荐进行降脂治疗。鉴于这些是个案报道以及缺乏前瞻性数据，目前尚不清楚获得测序数据是否对患者有益。
这些案例说明，在医生安排检测前讨论查见未考虑到的变异或VUS的可能性很重要，在发现此类变异后有遗传咨询师和其他经验丰富的亚专科医生来指导患者也很重要。
四、结论
1、疾病基因筛查结果阴性概率占比一半
尽管 NGS 技术呈指数级增长和发展，但通过WES或WGS进行基因诊断调查的个体中至少有50%仍未得到诊断，从而在许多层面上阻碍了疾病管理。原因包括WES的测序偏差、计算机预测工具和过滤能力较差，以及 WGS 中产生的大量 VUS。
2、基因筛查需要临床病症与特异性检测阳性才能加大确诊率
当疑似遗传代谢障碍疾病的患者表现出癫痫、智力障碍、精神异常等脑病病症，其中这些异常的临床病症（癫痫、智力障碍、精神异常），属于临床特异性病症表现，作为疾病筛查的线索，临床医生还要做体表检测，以及检测患者眼睛、心脏、肌肉、肾脏等临床线索是否有异常（参见：遗传代谢病临床诊断的蛛丝马迹线索合集 与 遗传代谢诊断检测：血尿串联质谱、血气、乳酸、血氨、肝肾功能等），其中一些血液、尿液的筛查线索如果出现非特异性结果，例如患者临床表现仅仅为自闭症、智力发育迟缓等，而患者的非特异检测发现线索，患者血液血氨升高且血氨基酸：瓜氨酸、丙氨酸升高；尿有机酸里的乳清酸与嘧啶升高，这个时候就要怀疑患者有尿素循环障碍方面的疾病，有了这些临床检测特异性与非特异性指标，可以把患者疾病诊断方向缩小到一个范围，再针对这个范围进行基因筛查，可以大大提供检测几率，避免大海捞针式筛查出现阴性结果。
3、基因检测结果阳性也需要结合患者临床症状与疾病对应的检测
单一的基因筛查结果阳性，并不能确诊是否是该疾病，还需结果临床线索指标验证，也要排除是否患者是晚发型的。基因筛查结果需要结合患者临床指标进行验证（上述特异性与非特异性指标），有的时候会检测到一些致病基因与患者临床表型不一致，这个时候需要收集患者临床线索去验证，当临床指标无法验证的时候，除了表明这个基因突变是一个疑似诊断，同时需要怀疑患者是否是晚发型的，可以将这个基因的突变当做一个医疗提示，从而进行医疗管理的临床预警。
4、基因检测结果阴性并不能完全排除疾病风险
一部分患者可能有“未解决”或“阴性”的遗传结果，这意味着所应用的测试方法未发现基因突变。这并不排除这种情况不是由遗传原因引起的，临床有提示遗传代谢障碍类病症表现的患者，基因筛查结果阴性，这种情况不能完全排除患者的患病风险。例如有明显某类疾病的特殊的临床表现：脑部疾病表现、特殊面容、头发特征、皮肤特征、临床血尿特异性筛查结果阳性、该疾病特有的脑部核磁影像特征等。
这种情况原因包括：
临床检测线索不足，大海捞针的基因筛查出现了遗漏
当前技术的局限性
可能需要另一种提供更多细节的测试方法，例如是线粒体环基因的问题，而大部分患者都是全外显子测序WES，全外显子对线粒体基因的检测有局限性，还有的是内含子突变，这种就要行全基因测序WGS
对与该特定病症相关的致病基因的了解有限
因为上述情况临床医生可能会建议患者在医院存储基因数据，并在当前技术有新发现或改进时重新分析，也可以在患者出现临床特异性病症或检测时候，联系基因公司进行重新分析基因数据。
酶学检测确诊证据级别有时候大于基因测序的结果，有的疾病有对应的酶检测，当患者检测出来酶活性低于正常人且有该疾病的症状时可以确诊该疾病，而如果这类患者基因检测时出现阴性结果，可以根据患者需求与医生建议是否进行下一步的深挖。
5、基因检测原始数据的保存大有用途
对于基因筛查阴性的患者，可以联系基因公司拿到原始数据，可以提供给其他专业的医生，在有科研基因筛查的时候，进行多个渠道重新筛查，也有一定的几率查出病因。临床有位患者有临床病症表现是指向线粒体疾病，但是相关基因检测结果阴性，该患者在专业的医生指导下将基因数据留在该医院，结果后期医院通过对基因库的定期分析查到疾病点位，并帮助患者确诊疾病与进一步疾病管理。
6、定期对基因数据重新分析
患者也可以根据后期临床检测出的其他证据，要求基因公司二次分析。同时基因库每年都在更新，会有很多疾病新点位入库，所以患者可以要求基因公司定期进行重新筛查。
7、基因检测尽量选择大公司或者专业的针对型公司
往期合集：
遗传代谢诊断检测：血尿串联质谱、血气、乳酸、血氨、肝肾功能等
自闭症、脑瘫、癫痫、精神异常、抑郁症、智力障碍等神经异常疾病
END
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