冲破层层迷障，第三代ADC已崭露头角
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小药说药 · 05期
目前在临床开发或临床应用中的许多ADC，都是基于一种完全内化的IgG形式，以极高过表达的抗原为靶点，并使用随机生物结合技术与微管蛋白聚合抑制剂偶联。已知可裂解连接体在胞浆循环过程中不稳定，而这种疏水性连接体具有较高的聚集倾向。然而，基于完整IgG的ADC在富含基质的肿瘤中可能会有肿瘤渗透的问题，并且被新生Fc受体（FcRn）回收，可能导致内皮和肝脏中的不利分布，从而导致不良反应。
此外，在内化后，ADCs的有效性是基于细胞内转运到达溶酶体，在那里连接体被降解使药物受控释放。然而，这种策略有几个限制因素：首先，ADCs的内化能力与表面Ag的高表达密切相关（例如，CD30和HER2），这解释了为什么这些使用传统微管蛋白聚合抑制剂（auristatins和maytansinoids）的ADC在抗原表达低的细胞上没有表现出细胞毒性活性。已经有更强大的药物，例如，吡咯苯并二氮卓（PBD）二聚体开发出来以克服这些局限性，但是相应的ADC的治疗指数有限，尤其是在实体瘤中。其次，包括Kadcyla®在内的ADC通过多种机制诱导肿瘤耐药。
事实上，包括单抗的内化、转运或再循环有关的干扰、抗原的脱落以及ADC的溶酶体降解缺陷都会导致药物释放的减少，从而影响ADCs的疗效。因此，需要开发与生物结合、载体形式、连接体或毒性药物相关的新技术，以拓宽ADC的应用领域。
位点特异性的ADC
尽管ADC取得了越来越大的成功，但直到2019年，市场上每一个批准的ADC都是以异质混合物的形式存在的，单抗上的细胞毒性药物数量不同且分布在不同的地方，导致了生产过程中的分析问题。事实上，DAR是不受控制的，这种复杂的混合物会显著影响ADC的药代动力学和药效。
裸抗体可能是一种竞争性抑制剂，弱DAR偶联物的疗效较差，而具有高DAR的抗体在血浆中会被迅速消除，从而损害了ADC的治疗窗口。为了拓宽ADCs的治疗指数，自2008年以来，区域特异性生物结合方法得到广泛发展。这些位点特异性方法可分为三类：（i）天然或非天然氨基酸的生物偶联，（ii）使用酶的生物偶联或（iii）基于连接物的生物偶联。
第一种方法是通过抗体工程引入特定的氨基酸。Junutula和他在Genentech的同事是先驱者，他们通过在靶向卵巢癌抗原MUC16的单克隆抗体的265位氨基酸与Adcetris®连接子进行定点生物偶联，开发出一种ADC。为此，他们在单克隆抗体的氨基酸序列中引入了两种半胱氨酸，选择了这两种半胱氨酸来保持IgG折叠和与抗原结合。
来源参考文献1
将得到的TDC（ADC-硫单抗）与使用传统随机生物结合方法生成的ADC进行比较。两种ADC在小鼠异种移植模型中均有效，但TDC在大鼠和食蟹猴体内的耐受性高于ADC，并且在体内表现出较低的全身毒性。受此策略的启发，Seattle Genetics和Spirogen开发了一种类似的技术，称为MAIA，通过在mAb关键区域的239位引入丝氨酸半胱氨酸突变，实现PBD二聚体的生物偶联。
第二种可能性是使用酶介导的区域特异性生物结合技术。谷氨酰胺转胺酶催化天然单抗的谷氨酰胺侧链与含有伯胺的分子之间形成酰胺键。基于此，Innate Pharma已经开发了一种使用谷氨酰胺转胺酶构建ADC的三步方法，如下图所示。
来源参考文献1
最后，区域特异性ADC也可以从天然单抗中产生。在这一策略中，由创新的二溴甲基酰胺（DBM）或二噻吩基马来酰亚胺（DSPh）组成的异质双功能连接体可以通过区域特异性生物偶联产生更均匀和更稳定的ADC，DAR为4。
来源参考文献1
尽管其疗效显著，但大多数针对实体肿瘤的ADC并没有超过2期临床试验的进展，这表明，为了进入市场，还需要优化其他参数。ADC的有效性受到其大小（150 kDa）的限制，与肿瘤的穿透和吸收不良有关。除了IgG的大小，现在人们认为IgG的Fc部分对于ADC的疗效来说是不必要的，甚至是不需要的，事实上，由FcRn诱导的ADC半衰期较长增加了对健康组织的暴露，而FcγR与内皮细胞和免疫系统发生交叉反应，这两种现象与靶外毒性有关。
较小的结合形式已被探索以弥补这些缺点，特别是肽、单域抗体片段（sdAb或VHH）、单链抗体（scFv）、抗原结合片段（Fab）或使用CHε4结构域二聚化的小免疫蛋白（SIP）。作为该策略的一部分，最近，auristatin衍生物与抗HER2单链抗体（源自曲妥珠单抗）的位点特异性偶联产生了两种新的单链抗体药物偶联物（SDCs）。
来源参考文献1
与天然单链抗体相比，这两种SDC保持了对HER2的亲和力，并且能够在体外有效地杀死SK-BR-3her2阳性细胞（EC50分别为0.68nm和0.32nm），对HER2阴性MCF-7细胞无影响。尽管DAR为1的SDC不如相应的DAR为4的ADC强大，但这项工作代表了设计具有更高DAR的更有效的小型结合物的第一步，为进一步的体内或甚至临床研究开辟了道路，以评估其对实体瘤的潜力。
目前以HER2为靶点的ADC在清除表达相对较低HER2+癌细胞方面是无效的。因此，只有大约20%的乳腺癌患者有资格接受HER2靶向治疗。此外，HER2表达的肿瘤内异质性最终导致最初对治疗有反应的患者复发。为了在具有更广泛HER2表达范围的癌细胞中获得有效的抗肿瘤活性，MedImmune开发了针对HER2的双翼ADC IMMU4276。
来源参考文献1
与Kadcyla®相比，在代表不同亚群患者的各种肿瘤模型中，这种双翼ADC显示出优越的抗肿瘤活性。此外，两个组合突变（L234F和S239C）减少了与FcγR的结合，以减少FcγR介导的正常组织中ADC特异性内化，从而减少了血小板减少等副作用的发生。不幸的是，由于高肝毒性，2018年该ADC也在临床停止。
新靶标和相关释放系统
在富含细胞间质的实体瘤中，在癌细胞表面靶向内化抗原是非常困难的。因此，一种新的方法被开发出来，由肿瘤微环境（基质或血管系统）代替癌细胞。在这种策略中，细胞外蛋白酶和细胞外基质的其他成分（如酸性介质或还原性谷胱甘肽）可用于有效的细胞外释放用于非内化ADC的细胞毒性。
纤维连接蛋白是肿瘤内皮下细胞外基质的一种成分，与癌细胞表面相比，更容易获得免疫结合。SIP形式是单链抗体片段与人IgEεCH4结构域融合的结果。SIP（F8）在C-末端位置用两个未成对的半胱氨酸残基生成，允许两个DM1分子进行区域特异性生物偶联，以产生SIP（F8）-SS-DM1的DAR=2的偶联物。
来源参考文献1
在治疗实验中，SIP（F8）-SS-DM1比IgG（F8）-SS-DM1的类似物效果更好。在F9畸胎瘤小鼠模型中，以5mg/kg 5次注射给药，以相等（等摩尔）剂量在体内比较两种偶联物。SIP偶联物使五分之四的小鼠肿瘤完全缓解，而IgG结合物仅观察到有限的肿瘤缓解。这两种结合物也被证明在细胞毒性DM1释放动力学方面存在显著差异。非内化ADC的优点是避开了免疫结合物内化的某些抵抗机制，而区域特异性生物结合方法控制DAR，避免了DAR为0的成分出现。
新型细胞毒性药物
新的细胞毒药物已经被开发出来，以靶向低抗原表达或对auristatins或maytansinoids耐药的癌细胞。为此，人们开发了PBD二聚体，这些二聚体的分子结构包含两个烷基化亚胺官能团，能够与DNA形成共价键。PBD二聚体比传统细胞毒性药物（MMAE或DM1）的效力高约50-100倍。Spirogen和Seattle Genetics将PBD二聚体作为ADC细胞毒性物质引入，并开发了SGN-CD33A（vadastuximab-Talinine）和SGN-CD70A，然而很不幸，这两种基于PBD的ADC最近在III期临床试验中被迫停止。SGN-CD33A与致命感染和可能的肝毒性导致的较高的患者死亡率相关，而SGN-CD70A与血小板减少有关。
来源参考文献1
虽然在临床试验期间停止了使用talirine的ADC，但两个使用相应的tesirine的ADC处于临床研究的高级阶段。Rovalpituzumab tesirine（Rova-T或SC16LD6.5）是由abbvie（Stemcentrx）开发的抗DLL3 ADC，在小细胞肺癌的III期临床试验中进行了测试。
ADC Therapeutics开发了loncastuximab-tesirine（ADCT-402）和camidanlumab-tesirine（ADCT-301），这两种药物都在关键的II期临床阶段分别针对B细胞急性淋巴细胞白血病和霍奇金淋巴瘤进行了测试。
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Genentech最近开发了一种新的抗CD22-NMS249 ADC，新的蒽环类化合物命名为PNU-159682。蒽环类药物是目前应用最广泛的化疗药物之一，在治疗侵袭性非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面非常有效。该ADC使用MC-VC-PAB-DEA接头，带有一个加长的自锁间隔区，除了传统的PAB外，还包括N，N′-二甲基乙二胺（DEA）。在体内，这种抗CD22-NMS249 ADC在异种移植瘤模型中与抗CD22-VC-MMAE ADC一样有效，而在基于抗CD22-VC-MMAE ADC的细胞系的模型中仍然有效。证明了蒽环类ADC在治疗MMAE耐药癌症中的有效性。
来源参考文献1
作为先前所述ADC的替代品，海德堡制药公司开发了一种称为ATAC（针对抗体靶向鹅膏蛋白结合物）的专利技术，该技术基于强RNA聚合酶II抑制剂。α-和β-鹅膏碱是两种著名的鹅膏毒素，在四十多年前的蘑菇中鉴定出来。HDP-101是由HDP30.2115（α-鹅膏蛋白的稳定类似物）通过组织蛋白酶B敏感连接物与靶向B细胞成熟抗原（BCMA，CD269）的硫单抗（由Genentech设计）定点偶联，产生DAR为2的ATAC。
BCMA已经成为治疗多发性骨髓瘤的一个非常有选择性的靶点。在体内，在多发性骨髓瘤的各种异种移植模型中，HDP-101导致小鼠肿瘤完全缓解，安全性研究在小鼠和猴子身上确定了一个非常有利的治疗窗口。ATACs是一类非常有前途的化合物，但目前仍处于临床前阶段。
第三代的成功典范：
Enhertu®和Trodelvy®的批准
在许多开发ADC的公司中，Immunomedics设计了一个令人惊讶的ADC，通过三重赌注：构建一个针对稍微过表达靶点的ADC，使用了一个混合了细胞内和细胞外释放的系统，以及比常规使用的有效载荷更弱的毒性药物。Sacituzumab-govitecan（IMMU-132）是一种抗TROP-2单抗，通过具有短聚乙二醇化单元的可裂解马来酰亚胺连接体与SN-38（伊立替康的活性代谢物）偶联。
FDA于2020年4月批准，这一成就令人印象深刻，因为这种ADC用于难治或耐药的三阴性乳腺癌（TNBC），之前没有有效的治疗药物。这种ADC的另一个有趣的特点是：包括聚乙二醇化单元的连接结构的优化使得该ADC的DAR高达7.6，而不会影响其耐受性或效率。DAR=4长期以来被认为是最佳的，但这一说法现在只适用于已知认可的ADC，其有效载荷为DM1或MMAE的第二代接头。
来源参考文献1
同样，为了使伊立替康衍生物与精心设计的连接体结合，日本第一三共公司开发了DXd（exatecan或DX-8951）。DXd是一种比SN-38体外对癌细胞活性高10倍的细胞毒性剂。DXd具有更好的安全性和最佳的溶解度，能够引起旁观者杀伤效应杀死邻近的癌细胞，这在异质性肿瘤中是一个优势，但半衰期短，可避免靶外毒性。
通过对蛋白水解敏感的马来酰亚胺连接体将DXd生物结合到抗HER2曲妥珠单抗半胱氨酸残基上，使得获得均匀DAR为7.7的共轭fam-trastuzumab-deruxtecan nxki（DS-8201a）。尽管DAR很高，但第一三共的DS-8201a在大鼠和猴子中的耐受性非常好，并且在血浆中非常稳定。
来源参考文献1
DS-8201a能够在体内有效地将DXd输送到异质性肿瘤中，并显示出很高的治疗效果。去年，在转移性HER2阳性乳腺癌的III期临床研究中，DS-8201a成功地与T-DM1进行了比较，并最终于2019年12月底获得FDA批准。
1. Antibody–Drug Conjugates: The Last Decade. Pharmaceuticals 2020, 13, 245
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BiG专栏作者
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