ADC的研发壁垒：核心三要素和偶联技术
文：平安证券
分析师：叶寅、黄施齐
ADC自概念提出至今已超过100年，但是上市品种仍然较少且在研品种多数仍处于早期的主要原因是ADC药物开发难度较大，技术壁垒较高。ADC药物在进入体内后需要经过多个步骤才能生效，每个步骤都有需要克服的技术难点。
ADC药物的构建核心主要包括三要素和组合技术。ADC由三个部分组成，每个部分都能影响ADC最后的疗效和安全性。
ADC对靶点的选择具有较高要求。
在确定了目标适应症后，首先需考虑的是哪些抗原在该类肿瘤细胞表面具有特异性且高水平的表达。靶点是ADC药物主要识别肿瘤细胞和被内吞的主要媒介，其适用性是ADC药物治疗窗口和效果的关键决定因素之一，并且将影响药物的成药性和竞争格局。由于ADC药物发挥作用的机制和现有疗效均有差异，因此对于靶点特性的要求较为特殊：
具有肿瘤特异性。为了减少脱靶毒性，靶点应该在肿瘤细胞上具有排他性或优先性表达，而在正常组织上不表达或者低表达。例如，HER2受体在肿瘤上的表达量约为正常细胞的100倍。
在肿瘤细胞表面大量表达。ADC药物通过血流到达肿瘤细胞并识别表面抗原从而发挥作用，因此靶点需要在肿瘤细胞表面稳定且大量表达以便循环ADC结合使用，抗原密度应以高拷贝数（>105 /细胞）存在。
抗原应是不分泌型的。分泌型抗原可与体内循环系统中的ADC药物或裸抗结合，从而导致与肿瘤细胞结合的ADC 药物减少，影响药物的疗效和安全性。
可以被有效内化。ADC药物在结合靶点后需要通过受体介导的内吞作用进入细胞，并且应进行适当的细胞内运输和降解，从而释放细胞毒性弹头。细胞表面的靶抗原可能具有不同的基础和抗体诱导内化率，这会影响ADC功效，不充分或低效的内化可能会增加脱靶毒性。
ADC药物研发正在持续拓展靶点选择。根据全球在研管线趋势，目前处于研发阶段的ADC药物中，研发热度最高的主要是肿瘤特异性较高并且已有上市产品的成熟靶点，例如实体瘤中的HER2、TROP2、Nectin4、EGFR，以及血液瘤中的CD22、BCMA、CD19和CD20等，这类得到验证的靶点赛道已较为拥挤。伴随基础研究的推进，目前ADC靶点的选择逐渐开始向创新靶点延伸，并基于药物作用机制的特殊性，开始探索ADC特有靶点。
肿瘤微环境相关靶点的耐药性突变更少。从靶点类型来看，除了在肿瘤细胞上特异性表达的靶点，肿瘤微环境相关的靶点也成为了研发热点，包括新血管系统、内皮下细胞外基质和肿瘤基质中的抗原。靶向基质的ADC通过降低基质产生的生长因子的浓度导致肿瘤细胞死亡。由于所有肿瘤细胞的存活都依赖于血管生成和基质因子，因此靶向此类组织的ADC可能具有更广泛的功效。此外，这些细胞与肿瘤细胞不同，其基因组相对较为稳定，产生耐药性突变的可能性相对较小。
抗体的选择影响ADC药物内吞效率
在选定了靶点后，为ADC选择合适的抗体也很重要，会对疗效、药代动力学/药效学特征和治疗指数产生重大影响。用于ADC的理想抗体应该具有很强的目标结合亲和力。此外，它还应具有高稳定性、低免疫原性、高效内化和长血浆半衰期。
免疫原性主要和抗体来源相关。在ADC药物刚开始研发时，主要使用的仍然是鼠源性抗体，较强的免疫原性导致副作用较大，研发失败率较高。伴随抗蛋白工程和基因工程的技术进步，抗体也逐渐向人源化方向发展，免疫原性持续降低，目前已经能做到全人源化，提升了ADC药物的研发效率。在已上市ADC药物中，仅Adcetris使用嵌合抗体，其他上市药物以及目前正在开发的大多数ADC使用人源化或人单克隆抗体。
抗体的半衰期和效应子功能与抗体亚型相关。目前IgG是主要用于开发治疗药物的抗体类型，而在IgG的4种亚型中，IgG1是目前最常用的类型，这主要是IgG1相比其他亚型具有一定优势：
IgG1和IgG3与Fc受体的亲和力高于IgG2和IgG4，具有更强的激活抗体依赖的细胞毒性（ADCC）及补体依赖的细胞毒性（CDC）效应，而IgG2和IgG4有阻碍或抑制的效应功能；
而IgG3由于与Fcγn的受体结合率较低，导致其清除速度较快，半衰期约为7天，因此较少被应用，而其他亚型在血清中的稳定性相似，半衰期约为21天；
IgG2虽然也可以有效触发补体效应，但会形成二聚体，可能导致聚集并导致ADC无效；
IgG4抗体可以形成新的双特异性抗体，稳定性较低。当不需要募集宿主效应器功能时，IgG4是ADC开发的首选。目前上市的ADC中，Mylotarg和Besponsa使用的是IgG4抗体。
抗体内化效率主要和抗体对抗原的亲和力相关。ADC使用抗体的亲和力越高，内化效率越快，但具有极高抗原亲和力的抗体会导致实体瘤穿透效率降低，会影响ADC药物到达肿瘤内部的效率。因此，抗原必须以合理的亲和力（Kd≤10 nM）被抗体识别和结合，以确保在靶细胞中快速吸收。同时，还需要考虑选择的抗体分子量大小，当抗体分子量太大时，难以透过毛细管内皮层和细胞外间隙，抗体的分子量太小可能会影响其在体内的半衰期。
ADC抗体的优化方向主要是提高内吞和渗透效率。当前，缺乏疗效和脱靶毒性是ADC药物面临的主要挑战，其中一个重要原因便是到达肿瘤的ADC药物较少和内化速率有限。目前研究人员正在开发解决提高递送效率和内化速度的方法，如提高渗透率和使用双特异性抗体的ADC药物：
使用双抗增强亲和力和特异性。双抗可以同时与同一靶细胞上的两种抗原相互作用，这种特性可能会增加治疗窗口，同时减少对非靶细胞的非特异性作用。此外，使用靶向两个非重叠表位抗原的双抗可以增强抗体对抗原的亲和力，从而提高ADC药物的内吞效率。
去掉Fc端提高渗透性。由于ADC药物的尺寸较大，基质屏障和肿瘤组织渗透是ADC治疗实体瘤需要克服的障碍。由于抗体在整个结构中结构占比较大，因此目前方法主要是针对减小抗体分子量。例如使用scFv（可变区）或sdAb（纳米抗体）作为砌块构建抗体，由于这两个模块分子量较小，构建出来的抗体相比IgG较小，能够更快渗透进肿瘤。
旁观者效应解决结合位点屏障。另一个可能导致肿瘤渗透性差的因素是结合位点屏障效应。这是一种现象，对血管附近的靶抗原具有高靶标亲和力的抗体可能由于抗原的快速和紧密结合而在远离血管的分布较少，导致ADC药物清除肿瘤效率下降。能够改善渗透性和分布的小尺寸 ADC 可使用“旁观者效应”，对邻近肿瘤细胞进行杀伤，解决位点屏障。
连接子的选择影响ADC稳定性和效率
连接子会影响治疗窗口。连接子是关系到药物稳定性和治疗窗口的关键之一。
首先，连接子需要具备一定的稳定性，从而在未达到肿瘤细胞之前，能确保ADC在血液循环过程中的完整性，避免提前释放毒素导致脱靶毒性，影响ADC药物的治疗窗口。而在进入靶细胞后，连接子要确保毒素的有效释放，发挥杀伤作用。连接子从性能上可分为不可裂解连接子和可裂解连接子：裂解型的连接子可利用肿瘤微环境特异性释放小分子毒素；非裂解型是通过细胞内溶酶体断开抗体和连接子的连接。
可裂解连接子根据裂解机理不同分为：化学裂解连接子和酶裂解连接子，其中化学裂解连接子包括腙键和二硫键，酶裂解连接子主要包括葡萄糖键和多肽键。
1) 腙键：对pH值敏感。在血流中性pH下结构稳定，而在酸性细胞区室，例如溶酶体（pH 4.8）或晚期内体（pH 5.5-6.2）中会被水解释放有效载荷。然而，该接头在循环过程中并不稳定，在血液中会缓慢水解，存在毒素脱落，目前其应用主要局限于血液瘤。
2) 二硫键：对谷胱甘肽敏感。血液中谷胱甘肽（GSH）的浓度为5 µmol/L，远低于细胞中谷胱甘肽的浓度（1–10 mmol/L），而肿瘤细胞会引起氧化应激，从而产生高 GSH 水平，促进有效载荷的释放。因此，二硫键连接子在血液中非常稳定，并具有一定肿瘤特异性。
3) 葡萄糖键：对糖苷酶敏感，例如β-葡萄糖醛酸酶。含有β-葡萄糖醛酸的ADC可以达到DAR=8，而不会引起聚集，也不会降低 ADC 的疏水性。事实上，这种类型的接头大大降低了 ADC 的血浆清除率，从而提高了它们在体内的功效。
4) 多肽键：会被组织蛋白酶B酶解，这是一种溶酶体蛋白酶，在肿瘤细胞中过度表达，而在血液中存在蛋白酶抑制剂。因此，这种连接子在循环中高度稳定，而进入肿瘤细胞后会被溶酶体蛋白酶B酶解，以活性结构释放细胞毒素，较好的保持了其的理化特性。
不可裂解连接子由稳定的键组成，在血循环和肿瘤细胞内均可保持稳定。
1) 比如硫醚连接子、酰胺类连接子。不可裂解连接子依赖于蛋白酶对ADC的抗体成分的酶解，最终释放出与来自降解抗体的氨基酸残基相连的有效载荷分子。因此，当与不可切割的接头结合时，需要仔细选择和设计有效载荷结构，以便有效载荷能够以这种修饰形式发挥抗肿瘤效力。Roche的Kadcyla是通过稳定的硫醚连接子将DM1连接到抗体上。
旁观者效应是两种连接子的主要区别之一。不可裂解连接子必须在ADC的抗体被降解后释放毒素，这种形式的ADC不会产生旁观者杀伤，因为通常连接子-毒素复合物的正电荷阻止其穿透细胞膜从而无法进入周围细胞。而可切割连接子在细胞内或细胞外被降解后，释放产生的游离药物将直接杀死靶细胞，并可以扩散出靶细胞以引起邻近不表达靶抗原的细胞死亡，进一步增强肿瘤杀伤能力。
目前ADC药物的药物抗体比（DAR）限制较为严格，有效载荷超过4就较易在血浆中聚集并被清除，而DAR的增加会直接影响ADC对于肿瘤的杀伤力，为进一步提高药物治疗窗口，降低最低有效剂量，目前连接子的主要研发方向包括提高连接子的亲水性和增加连接子上有效载荷的承载数量：
提高连接子的亲水性。目前已证明 ADC 疏水性的增加与 ADC 清除率的增加有关，而 ADC 的清除率可以通过接头-药物设计进行修改，使用基于肽键的亲水性接头的Enhertu和聚乙二醇化 ADC 证实了这一点。因此，有望通过增加连接子亲水性降低由于DAR增加导致的清除。
增加连接子上有效载荷的承载数量。迄今为止开发的大多数ADC的连接子仅加载单个有效载荷。然而，最近的研究表明抗体可以与两个以上的有效载荷相关联。Anami及其同事最近报告了他们在分支连接子上的研究进展，该连接子可以加载多个有效载荷分子，提高药物效力。
毒素的选择影响ADC药物效力
毒素是发挥肿瘤杀伤作用的组成部分。在ADC药物进入细胞后，毒素是最终造成靶细胞死亡的主力军，因此，毒素的毒性和理化特性会直接影响药物对于肿瘤的杀伤能力，从而影响疗效。用于偶联的细胞毒素必须具有较为清晰的作用机制、较小的分子量、较高的细胞毒性，并且采用化学方法偶联到抗体上后仍能保留抗肿瘤活性。
具有较高细胞毒性。考虑到抗体较差的渗透能力和内吞效率，以及细胞表面较低的抗原表达量，最终能被递送到靶细胞中的有效载荷数量有限。假设ADC作用机制中的每个步骤的效率为50%，那么只有1.56%的毒素能够进入细胞并发挥作用，而人体中的实际数据更低。因此，为了保障药物作用，ADC选择的毒素需要具有足够高的毒性效力以有效杀伤肿瘤。
具有较小的分子量。ADC整体分子量增加可能会导致ADC药物的聚集，使其被较快清除，因此，毒素的分子量应控制在合理范围。此外，较小的分子量使得毒素可以透过细胞膜扩散到邻近细胞，发挥旁观者效应，进一步增加肿瘤清除效果。
作用机制较为清楚。由于ADC药物是通过被靶细胞内化发挥效果，因此毒素主要是在细胞内被释放，需要靶向细胞内靶点，并通过凋亡机制诱导癌细胞死亡，因此作用机制需要明确。
采用化学方法偶联到抗体上后仍能保留抗肿瘤活性。某些细胞毒素如长春花碱和甲氨蝶呤偶联到抗体上后几乎失去抗癌能力，这类毒素就无法作为有效载荷。
根据作用机制不同，目前用于ADC的细胞毒素主要分为DNA损伤剂和微管蛋白抑制剂。
微管蛋白抑制剂
微管是细胞骨架的主要组成部分, 在细胞分裂过程中的起到重要作用。由于肿瘤细胞会保持快速增殖，因此，干扰肿瘤细胞有丝分裂的微管蛋白抑制剂成为肿瘤药物研发方向之一。该类抑制剂主要是抑制微管蛋白的聚合或者促进微管蛋白的聚合。其中，促进微管蛋白聚合剂作用于α-β微管蛋白二聚体的β-亚基，使微管生长不受调控，如MMAE、MMAF。而抑制微管蛋白聚合剂是通过抑制成熟微管的形成来阻断微管蛋白二聚体的聚合，如DM1、DM4。
DNA损伤剂
与微管抑制剂的纳摩尔范围相比，DNA损伤剂的IC50值仅为皮摩尔，因此使用DNA损伤剂作为有效载荷构建的ADC更有效，可以靶向在肿瘤上低水平表达的抗原，并且能够杀伤处于任何细胞周期的靶细胞。DNA损伤剂分为四种作用机制：(a) DNA双链断裂，例如卡奇霉素；(b) DNA烷基化，例如卡泽莱辛；(c) DNA嵌入，例如Dxd；(d) DNA交联，例如安曲霉素。
从毒素的IC50分布情况来看，ADC毒素至少要到nM级别。目前较为常用的这几种细胞毒素中，美登素相比海兔毒素毒性较大，而毒性最大的目前是DNA破坏剂中的PBD，是相对较为有效的有效载荷之一。PBD杀死癌细胞的作用方式是与癌细胞DNA的特定靶标结合并交联。因此，这可以防止肿瘤细胞增殖而不使其 DNA 螺旋变形，从而有可能避免出现耐药现象。
偶联方式的选择影响ADC药物均一性
偶联方式是最后的关键环节。
在决定了抗体、连接子和细胞毒素之后，三者的偶联方式会影响药物抗体偶联比（Drug Antibody Ratio，DAR）及ADC药物的均一性，从而影响ADC的生物学活性、耐受性及药物稳定性。如果偶联的细胞毒素过少，则会降低其生物活性和疗效；过多则增加ADC在血液中的清除率及安全性风险，同时影响抗原和抗体的有效结合。通常而言，理想的DAR为2-4。目前已进入临床的ADC药物所使用的偶联方式主要分为随机偶联和定点偶联。
随机偶联和定点偶联的主要区别是抗体DAR分布情况。DAR可能在0-8之间变化，因此，使用随机偶联会产生具有不同DAR的ADC的异质混合物，导致最终成品中ADC药物的有效性不一，影响药物整体疗效和剂量。而定点偶联的DAR较为明确，最终成品的一致性较高，提高治疗窗口。
随机偶联：目前已上市的药物基本都是使用随机偶联，会产生具有不同DAR的ADC的异质混合物，其药代动力学、活性和安全性各不相同，导致疗效下降。抗体上的半胱氨酸( 8个) 和赖氨酸残基( 80个) 较易发生化学反应而被修饰，因此常作为与效应分子结合的位点。
a) 赖氨酸酰胺偶联
在早期ADC的开发研究中，通常选择抗体上的赖氨酸作为结合位点，其合成效率较高。但由于每个抗体上的赖氨酸残基可达80个，导致了很大的异质性，平均DAR为3.5-4，分布在0-7之间，影响ADC药物的体内分布和细胞毒性，Kadcyla就是使用这种方式。
b) 半胱氨酸偶联
每个抗体上只有8个游离的半胱氨酸可通过二硫键与连接子连接，由于结合位点的数量有限和硫醇基团的独特反应性，用半胱氨酸作为连接位点有助于降低ADC的异质性。产生的DAR为2、4、6、8，相对优于赖氨酸，代表药物有Adcetris。
定点偶联：随着基因技术的发展，通过基因工程在抗体分子中引入具有活性基团的氨基酸，从而通过氨基或巯基的化学定点偶联毒素，实现对于DAR及产品均一性的有效控制。
a) 反应性半胱氨酸偶联（Thiomab技术）
最早由Genentech开发，在抗体两个重链上引入新的半胱氨酸残基，用于选择性抗体附着。这种经过改造的半胱氨酸技术能够稳定生成DAR为2的高度同质（占比高达92.1%）ADC。而在此基础上，新的方法不断提升DAR，包括通过将半胱氨酸残基进行硫醇芳基化和使用二溴重新桥接二硫键，这两种方法将得到DAR分别为4.4和4的ADC。
b) 糖基化连接
由于IgG是一种糖蛋白，它在Fc片段每个重链的CH2结构域N297位置包含一个N-聚糖，这种糖基化可以作为连接有效载荷的附着点。多糖与Fab区域间远距离定位降低了在偶联后损害抗体的抗原结合能力的风险，此外，与抗体的肽链相比，它们的化学组成不同，允许位点特异性修饰，使它们成为合适的偶联位点。
c) 非天然氨基酸
通过在抗体中引入β-乙酰苯丙氨酸作为非天然氨基酸残基，其含有天然氨基酸中不含有的酮官能团。酮官能团与烷氧基胺间可形成肟键，该键在生理条件下非常稳定。
d) 酶催化
有效载荷的附着可以通过在抗体序列中插入特定的氨基酸标签以非常有选择性的方式实现。这些标签被特定的酶所识别，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而能够执行位点特异性偶联。
结语
为了使ADC药物能够高效通过细胞内的生物过程从而发挥作用，在构建ADC时需要综合考虑抗体、毒素分子、连接子及偶联方式。
抗体：是ADC的精确制导部件，将毒素分子带到肿瘤细胞，其选择取决于疾病的靶标，可以分为特异性抗原和相关性抗原。
毒素：是影响 ADC 活性的关键因素，也是主要用于杀伤肿瘤细胞的有效分子，需要具备高毒性、高亲和力和低免疫原性。
连接子：起到连接作用，需要在血液循环中足够稳定，而在到达靶细胞表面或进入细胞后能够将小分子毒素有效释放。
连接方式：控制偶联小分子的位置和数量，保障均一的药物/抗体比率（DAR），稳定ADC药物在体内的分布代谢。
连接物-毒素化合物及偶联方式是核心要素。在整个ADC构建中，容易产生差异性和专利的核心部分是连接子和毒素的组合部分，及其与抗体的偶联方式。ADC药物的抗体选择是无限的，而目前连接物、连接方式及毒素的种类是有限的。
— THE END —
铁肩担道义，妙手著文章
BiG专栏作者/记者编辑招募中