铁死亡、细胞焦亡等细胞死亡方式的研究在过去两年的火热程度是有目共睹的，相关的纯生信研究也如雨后春笋。然而，好的研究方法多如牛毛，但是研究热点的把握却不是那么简单。
坏死性凋亡（necroptosis），作为2005年第一次提出的概念，最近被发现在肿瘤发生和转移中发挥重要作用，具有肿瘤治疗的潜能。从发文来看，已经有爆发的趋势（图1）。此外，目前还没有生信类的文章出现。铁死亡和焦亡没有把握住的话，坏死性凋亡是一个非常好的选择。
结合今年十月份的综述（Necroptosis and tumor progression, Trends in Cancer, IF: 14.226），我们详细的了解一下坏死性凋亡与肿瘤的关系。坏死性凋亡（Necroptosis），一种程序性坏死细胞凋亡，是宿主防御病原入侵的守门人。坏死性凋亡的失调同样是许多炎性疾病的关键因素。最近的研究揭示了坏死性凋亡在肿瘤发生和转移中的重要作用，提示靶向坏死性凋亡作为一种新的肿瘤治疗的潜能。虽然坏死性凋亡的分子机制已经得到了很好的研究，但是在肿瘤发生和转移中肿瘤细胞的坏死性凋亡的详细调控和功能才刚刚出现。坏死性凋亡是一种程序性炎性细胞死亡的形式，最初被发现是在死亡域受体参与后替代凋亡的一种方式。由受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）-RIPK3混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）组成的典型坏死性凋亡通路在死亡结构域受体（例如肿瘤坏死因子受体TNFR和Fas）和Toll样受体3/4（TLR3/4）的下游被触发。活性RIPK1在包含FADD、caspase-8和caspase-10的寡聚复合物中被招募。在缺乏caspase-8的情况下，RIPK1招募并磷酸化RIPK3，形成RIPPotosome，然后磷酸化MLKL形成坏死体。MLKL寡聚体在质膜上转移到富含磷脂酰肌醇磷酸（PIP）的斑块，形成大孔，通过允许离子内流、细胞肿胀和膜溶解导致坏死性细胞死亡，随后细胞内物质的不可控释放。免疫系统还进化出了绕过ripk1介导的RIPK3-MLKL上游激活信号来阻止病毒感染的方法。包含RHIM结构域的蛋白，如Z-DNA结合蛋白1 (ZBP1)和包含tir结构域的adaptor -inducing interferon-β (TRIF)，可以通过RIPK3的RHIM结构域直接与RIPK3结合，导致ripk1独立激活坏死性凋亡。因此，无论上游触发因素如何，RIPK3和MLKL都是坏死性凋亡的重要组成部分（图2）。与其他类型的程序性细胞死亡（例如铁死亡和细胞焦亡）类似，坏死性凋亡近年来被认为是调控肿瘤发生和进展的重要事件。坏死性凋亡信号通路在肿瘤发展、肿瘤坏死、肿瘤转移和肿瘤免疫反应中发挥作用。然而，研究结果表明，根据肿瘤类型，坏死坏死可能是原源性或抗肿瘤性的。肿瘤坏死通常见于实体肿瘤的核心区域，其原因是血管化不良和随后的缺氧和营养缺乏。在小鼠和人类实体肿瘤的坏死区域都可以检测到坏死性凋亡。虽然TNFpathway在肿瘤发生中发挥促生存和细胞毒功能，当前的假设是TNF诱导的坏死性凋亡是肿瘤细胞坏死性凋亡的原因，因为TNF最初的作用是引起肿瘤坏死。然而，最近的研究发现，在不同的肿瘤模型中，肿瘤细胞坏死性凋亡和肿瘤发展并不需要RIPK1作为TNF信号的中心节点，这表明TNF并不是肿瘤发展过程中触发肿瘤坏死性凋亡的主要因素。相反，葡萄糖剥夺似乎在肿瘤发展过程中诱导肿瘤细胞坏死性凋亡。在乳腺癌临床前模型中，葡萄糖剥夺导致线粒体DNA/RNA(mtDNA/RNA)释放到细胞质中。胞质mtDNA或mtRNA与ZBP1结合，以BCL-2家族蛋白noxa依赖的方式激活RIPK3-MLKL轴。虽然已知ZBP1介导病毒感染诱导的坏死性凋亡，但它也在各种不同条件下的坏死中发挥关键作用，包括RIPK1缺失诱导的死亡。这些发现进一步支持了肿瘤坏死与营养不良环境相关的观察，这些途径可以触发坏死性凋亡，而不依赖于RIPK1。ZBP1在其他类型肿瘤细胞坏死性凋亡中的重要作用还需进一步研究。最近的研究结果也表明，坏死性凋亡是小鼠乳腺癌模型中肿瘤坏死的一种主要的细胞死亡形式，因为肿瘤细胞中MLKL的缺失在很大程度上消除了肿瘤坏死，并将其余死亡区域的肿瘤细胞死亡模式转变为凋亡。然而，目前尚不清楚是否坏死性凋亡是所有实体瘤，特别是人类癌症肿瘤坏死的唯一原因。作为细胞凋亡后的继发性溶解性细胞死亡，焦亡也可能导致肿瘤坏死。程序性死亡配体1 (PD-L1)通过诱导和裂解gasdermin C (GSDMC)，将TNFα诱导的凋亡转变为癌细胞的焦亡，导致肿瘤坏死。目前还不清楚肿瘤中营养不良的环境是否通过葡萄糖缺乏诱导的坏死性凋亡以外的机制引发坏死。例如，当半胱氨酸供应受阻时，可诱发铁死亡。
Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)数据库显示，RIPK3在许多人类实体癌细胞系中低表达或无法检测到，但来自结肠、胆管和胰腺的癌细胞除外，它们表现出高水平的RIPK3表达。此外，RIPK3在几乎所有液体癌细胞系中均高表达，提示组织的发育起源和谱系规范决定了RIPK3在不同癌细胞中的表达。此外，RIPK3的沉默可能是来自基因的DNA甲基化表观遗传修饰的结果或致癌突变(如BRAF突变)。这种导致RIPK3低表达和抗坏死的表观遗传和遗传改变可能有利于癌细胞的生存。
事实上，变异的异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)产生的2-羟基戊二酸(2-HG)与DNMT1结合，诱导RIPK3启动子的高甲基化，使肿瘤细胞更抗坏死性凋亡。根据肿瘤类型和肿瘤发生过程中的条件，ripk3介导的坏死性凋亡似乎具有抗致瘤性或原致瘤性。一项研究报道，RIPK3的缺失既不影响myc驱动的淋巴瘤的生长，也不影响化疗诱导的恶性淋巴瘤细胞的细胞毒性。然而，RIPK3的下调与几种癌症的低存活率有关，如急性髓系白血病，提示坏死是抗肿瘤的。在机制上，RIPK3可能通过促进髓系白血病发生来限制髓系白血病发生ripk3 - mlkl介导的白血病起始细胞坏死和分化。此外，通过去甲基化药物恢复RIPK3可以协同增强几种一线化疗药物在乳腺癌模型中的疗效。相比之下，RIPK3的表达和坏死性凋亡在胆管癌和胰腺癌等高度恶性肿瘤的发生中可能是至关重要的，尽管其机制尚不完全清楚。在侵袭性复发乳腺癌中，RIPK3的上调对于癌细胞的强劲增殖也是必需的。来自侵袭性小鼠乳腺肿瘤细胞系MVT1的癌细胞在小鼠乳腺脂肪垫中生长时，迅速恢复RIPK3的表达，RIPK3促进这些肿瘤细胞的坏死凋亡。对于RIPK3介导的坏死对肿瘤发生的这些看似矛盾的作用，一种可能的解释是，除了介导坏死性凋亡，RIPK3在不同病理条件下的炎症反应中也是一个关键角色。虽然RIPK3表达的缺失或RIPK3激酶活性的抑制可以阻止坏死性凋亡，但它们也可以抑制RIPK3介导的炎症反应，如白介素(IL)-6和C-X-C基序趋化因子配体1 (CXCL1)，这是调节肿瘤起始和进展的关键因素。因此，ripk3介导的坏死性凋亡在肿瘤发生中的确切作用需要进一步研究。RIPK3介导的坏死性凋亡和炎症反应对肿瘤发生的影响应该通过MLKL基因敲除小鼠肿瘤模型来描述。然而，RIPK3介导的坏死性凋亡在不同类型的肿瘤和癌症发展的不同阶段都能发挥抗肿瘤和原肿瘤的作用。CD8+ T细胞通过抗原交联激活可获得抗肿瘤免疫。这可以由濒死细胞通过抗原呈递细胞(如树突状细胞)引起。激活肿瘤细胞坏死性凋亡增强抗肿瘤免疫。因此，以坏死为靶点诱导抗肿瘤免疫是一种可行的策略，特别是当细胞凋亡被阻断时。坏死细胞死亡过程中RIPK1的表达和NF-κB的激活对于有效的交叉引物和抗肿瘤免疫是必需的。同样，在实验小鼠模型中，接种坏死性凋亡癌细胞诱导了有效的抗肿瘤免疫。然而，坏死性凋亡在癌症免疫中的确切作用仍然存在争议。一些证据反驳了坏死细胞死亡的免疫原性。首先，坏死的肿瘤细胞释放高水平的钾，抑制CD4+和CD8+ T细胞的活性，从而阻断黑色素瘤抗肿瘤免疫。同样，胰腺导管腺癌(PDAC)细胞坏死性凋亡通路的激活在CXCL1-C-X-C基序趋化因子受体2 (CXCR2)-和中创建一个免疫抑制肿瘤微环境Sin3A相关蛋白130 (SAP130)-巨噬细胞诱导Ca2+依赖凝集素受体(Mincle)端依赖旁分泌的方式。此外，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中RIPK1的上调有助于胰腺导管腺癌(PDAC)的免疫耐受和免疫治疗耐药，因为TAMs通过stat1依赖的方式向m2样表型转变。与此同时，GSK的547抑制RIPK1可诱导细胞毒性T细胞活化，产生m1样表型，增强免疫治疗。然而，这一发现不能被另一种小鼠ripk1特异性抑制剂GNE684复制。虽然这两种不同RIPK1抑制剂的特异性可能导致了相互矛盾的结果，但另一种可能的解释是使用了基因不同的PDAC小鼠模型，p48Cre;KrasG12D (KC) and Pdx1Cre;KrasG12D;Trp53R172H (KPC)和Pdx1Cre;KrasG12D;p16/p19flox/flox(KPPC)andPdx1Cre;KrasG12D;p16/p19flox/WT;Trp53R172H (KPPPC)。在第二项研究中，由p16/19的额外缺失驱动的致癌程序可能会对RIPK1在肿瘤发展中产生不同的需求。虽然坏死性凋亡在调节肿瘤免疫中的作用还需要进一步阐明，但我们认为，慢性自发坏死性凋亡由于抑制某些类型癌症的抗肿瘤免疫而促进肿瘤的发展。化疗或放疗引起的急性大面积坏死性凋亡极大地破坏了肿瘤的生长并引发免疫原性反应（图3）。肿瘤细胞坏死性凋亡可能是肿瘤坏死的原因之一，肿瘤坏死通常与肿瘤的侵袭性和转移有关，被认为是实体癌预后较差的特征。事实上，在小鼠乳腺肿瘤中MLKL的缺失对晚期肿瘤的生长只有适度的影响，而MLKL消融阻断坏死性凋亡显著地减少了乳腺癌细胞的肺转移。这种转移能力的降低不是由于细胞在迁移中的自主缺陷，因为MLKL-null细胞的转移在与野生型细胞混合或静脉注射时没有受到损害，提示是坏死性凋亡的肿瘤微环境促进了肿瘤细胞的转移。与凋亡性细胞死亡不同的是，坏死性细胞死亡可有效去除死亡细胞而不破坏质膜，坏死性细胞死亡可导致“渗漏”并随后释放细胞内成分。各种细胞表面蛋白的分裂，如E-cadherin，是坏死性凋亡接合过程中的早期事件。崩解素和金属蛋白酶(ADAMs)分裂坏死性凋亡细胞中的E-cadherin，导致可溶性E-cadherin的释放，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。E-cadherin，以前被定义为肿瘤抑制因子和上皮标记物，已被证明在乳腺癌的转移中是必不可少的。E-cadherin抑制TGF β诱导的弥散性肿瘤细胞凋亡。此外，可溶性E-cadherin通过调节促生存信号和免疫抑制途径对E-cadherin的前转移作用至关重要。在B16-F10黑色素瘤转移模型中，除肿瘤细胞坏死性凋亡外，内皮细胞坏死性凋亡也可促进肿瘤细胞外溢和转移。在机制上，肿瘤细胞来源的淀粉样前体蛋白(APP)参与死亡受体6 (DR6)，激活内皮细胞坏死性凋亡，促进循环肿瘤细胞外渗。多个功能缺失模型证实了典型RIPK1-RIPK3-MLKL轴介导内皮细胞坏死性凋亡的必要性。然而，最近一项使用相同黑色素瘤模型的研究挑战了内皮细胞坏死性凋亡在转移中的重要作用。RIPK1抑制或RIPK3缺失（阻断内皮细胞坏死性凋亡）对转移没有显著影响。这些相互矛盾的观察结果可能是两项研究中使用的ripk3基因敲除动物不同以及用于静脉注射的细胞数量不同的结果。前者使用内皮细胞特异性ripk3敲除宿主，细胞更少，而后者是在整个体内进行的ripk3敲除背景使用更多的肿瘤细胞。综上所述，坏死性凋亡可通过多种机制促进肿瘤转移，但机制尚不明确，针对晚期肿瘤坏死性凋亡是一种有效的肿瘤转移治疗方法。
然而，坏死在肿瘤发展中的确切作用仍有争议。以坏死性凋亡通路的关键成分为靶点的基因工程小鼠模型(GEMMs)在不同类型癌症中的扩展工作，对于描述坏死性凋亡在肿瘤发生和转移中的确切作用，以及理解癌症中不同功能的坏死性凋亡的潜在机制至关重要。例如，未来的研究将阐明坏死性凋亡在肿瘤发生中的作用是否具有组织特异性，在不同类型的癌症中是否具有原致瘤性或抗致瘤性。因此，了解不同肿瘤模型中坏死性凋亡的不同功能的潜在机制，将为探索靶向阻断或诱导不同类型癌症的坏死性凋亡作为一种新的癌症治疗方法提供思路。
目前已经发现了多种以RIPK1和RIPK3为靶点的小分子，包括一些fda批准的癌症治疗药物。然而，这些坏死抑制因子在临床上翻译应用的一个主要障碍是RIPK1和RIPK3可能不是阻断坏死的理想靶点，因为RIPK1在某些病理条件下可能不是坏死的关键介质，RIPK1和RIPK3也是细胞炎症反应的关键介质。针对RIPK1会引发宿主的毒性，因为缺失RIPK1导致小鼠出生后死亡，靶向RIPK3激酶活性可能导致RIPK1-和caspase-8依赖的凋亡。最近几项针对RIPK1在不同疾病中的临床试验的失败进一步表明，这种激酶可能不是阻止坏死性凋亡的理想靶点。另外，靶向MLKL可能提供更好的治疗反应，因为MLKL只用于坏死性凋亡，而且它不影响小鼠的发育。尽管缺乏MLKL的特异性抑制剂，靶向MLKL寡聚是一种很有前景的缓解坏死性凋亡的方法。虽然争议仍然存在，但对癌症坏死性凋亡通路的持续研究将有助于提高我们对癌症生物学的理解，并找到新的方法来对抗这种疾病。