* 后台回复【 ADC Linker 】可获取本文相关资料！ 化疗作为癌症治疗的主要选择之一，其对癌细胞的选择性有限，治疗窗口较小，具有潜在的高毒性，因此限制了其临床应用。抗体药物偶联物(ADC)作为新兴的抗癌治疗药物，可以将高细胞毒性分子直接递送至癌细胞发挥杀伤作用。
ADC是由单克隆抗体通过Linker与细胞毒性化学物质(Payload)共价结合，Linker在ADC治疗效果中发挥着关键作用，其特性极大地影响ADC的治疗指数、药效学和药代动力学。
为了使ADC具有选择性和疗效，所采用的Linker应努力实现三个关键特性[1]：
(1)循环稳定性高：在Payload到达靶点之前不会释放Payload，从而将脱靶效应降到最低；
(2)高水溶性：有助于偶联并避免形成无活性的ADC聚集体；
(3)有效释放：允许有效释放高细胞毒性的Linker-Payload代谢物。
Linker由两个关键部分组成：抗体连接和Payload连接(图1A)[2]。Linker-mAb之间的键合至关重要，其决定了药物抗体比(DAR)，从而决定了ADC的均质性和稳定性；Linker-Payload之间的键合也同样重要。
图1. Linker在ADC中的作用(A)及分类(B)
可裂解与不可裂解Linker的区别、优劣
ADC所使用的Linker分为可裂解和不可裂解两种(图1B)[3]。对于不可裂解的Linker，进入溶酶体后，mAb通过蛋白水解机制进行代谢，释放的代谢物包含Payload、Linker和氨基酸附属物；若Payload的关键药效团不受影响，对Payload的大幅修改也可以产生有效的ADC，就像Kadcyla®[4]的情况一样。然而，由于带电氨基酸附属物缺乏细胞渗透性，不可裂解的Linker通常无法发挥旁观者效应[5]，因此含有不可裂解Linker的ADC应用范围受限，主要用于治疗血液癌症或具有高抗原表达的肿瘤。
相对于不可裂解Linker，可裂解Linker利用特定条件下在靶细胞处释放药物。可裂解接头可以进一步细分为化学可裂解或酶可裂解。尽管可裂解Linker在适用范围上通常优于不可裂解Linker，但其在血液循环中存在更大的不稳定性。因此，可裂解Linker的成功取决于它们有效区分血液循环条件和靶细胞条件的能力。
接下来，小编将重点介绍ADC在开发过程中使用的各种可裂解Linker。
化学诱导的可裂解Linker
化学诱导的可裂解Linker存在三种主要类型：酸可裂解、还原性条件下裂解(二硫化物等)和可通过外源刺激裂解的Linker。
2.1 酸可裂解Linker：Mylotarg®、Besponsa®、Trodelvy®
酸可裂解Linker旨在利用内涵体(pH 5.5–6.2)和溶酶体(pH 4.5–5.0)的酸性，同时在pH 7.4的生理条件下保持循环稳定性。这一策略在辉瑞的Mylotarg®取得最早的临床成功(AcBut Linker)[6]。虽然也采用了可还原的二硫化物，但Linker包含酸敏感的N-酰基腙键，在酸催化下，水解成酮和酰肼-Payload (图2A)；在其开发过程中，测试一系列含腙Linker在pH 4.5和pH 7.4下的稳定性以及其作为ADC一部分在小鼠体外和体内进行测试，在pH 7.4下稳定、在pH 4.5下不稳定的Linker提供了最有效的ADC。该种Linker-payload也应用到了Besponsa®。
除了上述所说的腙键外，Trodelvy®所使用的碳酸酯Linker也是酸裂解Linker的一种(图2B)。虽然理论上酯键在血液循环中比碳酸酯更稳定，但实验结果表明由前者构建的ADC在人血清中并不太稳定；通过引入对氨基苄基(PABC)间隔子可将ADC的血清稳定性显著提高(t1/2=36 hrs)，其对酸性溶酶体区室表现出一定的选择性，在pH 5时t1/2为10小时。
图2. Mylotarg®和Trodelvy®的酸裂解方式
除已上市的这三款ADC药物涉及酸裂解Linker外，还有很多文献报道涉及酸裂解(pH敏感) Linker (表1)[7-11]。
表1. 酸裂解(pH敏感) Linker作用机理
2.2 还原性条件下裂解Linker
尽管Mylotarg®、Besponsa®和Trodelvy®在临床上取得了成功，但大多数ADC连接技术已不再选用酸裂解Linker。Linker严格区分pH 5和pH 7.4环境的要求本质上是非常困难的，现在的研发重点是可以产生更高肿瘤选择性的其他方法。虽然在一些情况下，缓慢的释放Payload可以产生有益的结果，但这种方法通常仅能采用中等细胞毒性的Payload，现在ADC首选的高毒性Payload需要更稳定的Linker。
Mylotarg®和Besponsa®中Payload的释放不仅需要酸敏感的腙键发挥作用，而且Linker中的二硫键也发挥一定的作用。二硫键在生理pH值下稳定，但容易受到硫醇的亲核攻击(图3A)。在血浆中，主要的硫醇类物质是人血清白蛋白(HAS，~422 μM)的还原形式，但其对大分子的反应性受到阻碍，因为含游离硫醇的残基溶剂暴露性有限；与血浆有限的还原能力相反，胞质中含有高水平的谷胱甘肽(GSH，1–10 mM)；血浆和细胞质的还原条件为ADC选择性释放Payload提供了机会[12]。此外，和正常组织相比，与肿瘤相关的氧化应激通常会导致GSH水平升高，这增加了对癌细胞的额外选择性。
图3. 还原性条件下ADC药物的水解机制
涉及二硫键水解的Linker-Payload多含有美登素类化合物(DM1/3/4，图3B)以及二硫键氨基甲酸酯类Payload(图3C)。类似于二硫键可在还原性条件下进行Payload的释放，目前多篇文献报道了Linker可在肿瘤组织强还原性条件下释放Payload (表2)[13-15]。
表2. 还原性条件下Linker的裂解机理
虽然利用内源性裂解ADC Linker是最简单的药物释放方法，但通过外界刺激释放Payload可具有以下优点：(1)避免因患者之间的生物学差异而导致Linker裂解率的差异，以及(2)当内源性裂解不足以有效释放Payload时，ADC也可以发挥作用。已在日本上市的Akalux®采用的裂解方式为近红外光敏感的Linker，通过690 nm红光照射后释放毒性IRDye700发挥治疗作用，属于近红外光免疫疗法。除此之外，目前研究较多的有金属离子(Pt、Pd、Fe、Lu)催化裂解、UV/Vis和NIR光敏感的Linker (表3)[16-22]。
表3. 外源性刺激导致的Linker裂解
酶介导的Linker裂解
在ADC的经典作用机制中，ADC被运输到细胞的溶酶体，其中存在高浓度的独特水解酶，从而为酶可裂解Linker提供了在细胞内选择性裂解的机会。目前组织蛋白酶B的应用最为成功，目前上市的药物Adcetris®、Polivy®、Padcev®、Tivdak®、Aidixi®、Lumoxiti®、Zynlonta®、Enhertu®均使用组织蛋白酶B裂解的多肽Linker，其中对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)用作自降解间隔子，其在蛋白水解后自发进行1,6-消除，释放Payload、CO2和氮杂醌甲基化物(图4)；PABC保持独立于Payload的酶活性，增加了该中多肽Linker的适用范围。所有这些Linker组合在分离的人类血浆中都具有一定的稳定性。
除了应用较多的酶有组织蛋白酶B外，磷酸酶、(芳基)硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和硝基还原酶等也应用到ADC的构建当中(表4)[1-3, 23-28]。
表4. 酶介导的Linker裂解机制
其他可裂解Linker
基于生物正交化学具有不干扰正常生物过程、选择性高、处理快速简单、副产物无毒等特点，生物正交切割对也可作为Linker裂解触发器。采用经典的生物正交裂解对Cu(I)-2-[4-[[双[(1-叔丁基三唑-4-基)甲基]氨基]甲基]三唑-1-基]乙酸(BTTAA)和双取代的炔氧基羰基(dsProc)反应在癌细胞表面释放Payload (图5A)[29]。体外毒性实验表明，添加50 mmol/L Cu(I)-BTTAA可使含DOX-dsProc的ADC的IC50降低120倍。虽然该Linker扩展了裂解机制，但在底物稳定性、生物相容性和操作便利性方面仍有待改进，目前还不能在体内应用，距离临床应用还有很长的路要走。
除了上述反应外，IEDDA反应也可用于Payload的释放。该方法由Tagworks Pharmaceuticals引入，利用反式环辛烯(TCO)作为可裂解Linker，与四嗪激活剂发生点击反应生成4,5-二氢哒嗪中间体，然后转化为2,5-和1,4-互变异构体，其中只有后者可以进行随后的电子级联反应，从而释放出不同的Payload (图5B)[30]。IEDDA和互变异构步骤分别受到四嗪部分取代基的影响，并且通过具有相反的吸电子和斥电子特性的两个官能团的组合显示出更好的药物释放性能；此外，酸催化通过影响点击反应后的互变异构化来加速Payload的释放速率。最近的临床前实验中证明了四嗪-TCO对的“click and release”方法的可行性[22]。
合适的Linker是ADC安全有效的重要保障。虽然不可裂解Linker的例子也有很多，但由于游离态Payload的细胞毒性以及旁观者效应的重要性，可裂解Linker是大多数ADC药物的首选。可酸裂解的Linker最初很有前景，但高毒性Payload所要求的严格稳定性降低了其应用价值。相比之下，目前绝大多数ADC都采用多肽技术，因为它们能够有效区分血液循环和靶细胞条件，但这方面仍需进一步开发，以更好地解决溶解度、血浆稳定性等关键问题。此外，细胞外裂解对非内化ADC具有可适用性，消除抗原内化的要求，大大增加了可能的抗原靶标的数量，这可能为许多新的ADC疗法打开大门。
未来可裂解Linker的研究预计将进一步探索多种作用机制联用的可能性，包括外源性诱导裂解领域，该领域尚处于起步阶段。尽管基于非多肽的酶可裂解接头的临床前结果令人鼓舞，但尚未经过临床验证。新型可裂解Linker的研发任重道远，但随着我们更深入地了解不同Payload对肿瘤生物学的影响以及最佳Linker-spacer连接的临床验证，最终将开发出具有颠覆性功效的理想ADC，推动个性化药物的发展，以满足肿瘤学的急切医疗需求。
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