针对炎症靶点开发治疗自免的PROTAC

作者｜小鱼 

摘要：

诸多研究正在将与自免相关的炎症靶点和PROTAC两者相结合，比较热门的靶点是HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF，针对这些靶点设计开发用于自免治疗的PROTACs，在临床前阶段显示出良好的体外效力。

引言：

炎症可以是自身免疫性疾病的一个触发因素，也可以是其结果。例如，类风湿性关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病的发病机制中，炎症反应是关键的组成部分。此外，炎症性细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等在自身免疫性疾病的发展中起着重要作用。

图1 炎症信号通路

PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）是一种创新的蛋白质降解技术，其结构由三部分组成：一端是与目标蛋白（POI）结合的配体，另一端是与特定的E3泛素连接酶结合的配体，中间通过一个Linker（连接子）相连。这种设计使得PROTAC分子能够同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶，从而促进目标蛋白的泛素化，并通过泛素-蛋白酶体途径（UPS）实现目标蛋白的选择性降解。

图2 PROTAC结构及作用机制

通过设计特定的PROTAC分子，可以诱导与自身免疫性疾病相关的靶蛋白降解，从而为治疗这些疾病提供新的策略。在设计和评估PROTAC分子时，研究人员会关注其诱导靶蛋白降解的能力，这通常通过DC₅₀（半最大降解浓度）和Dmax来量化。DC₅₀是指能够导致目标蛋白降解50%的PROTAC浓度，而Dmax则表示在饱和浓度下PROTAC能实现的最大降解水平。现将HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF靶点的临床前PROTACs开发情况介绍如下：

1 HDAC VI（组蛋白去乙酰化酶6）

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类重要的酶，它们通过去除组蛋白上的乙酰基团来调控基因的表达。HDAC的功能异常与多种疾病的发生发展有关，尤其是癌症。阻断HDAC可导致细胞死亡和抗炎活性。用于癌症治疗的强效HDAC抑制剂，TSA（Trichostatin A）、SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）等，可以减少诱导关节炎大鼠的肿胀、血管形成和骨侵蚀。

HDAC VI是目前与自身免疫性疾病关联最大的HDAC家族成员，负责炎症的调节，阻断HDAC VI可治疗类风湿性关节炎，以改善滑膜炎症。以下是针对HDAC V1靶点的PROTAC开发情况：

Compound2：Cao等人引入了“点击”化学的概念，合成了由不同连接子长度组成的PROTAC分子。其中化合物2的体外研究显示，DC₅₀为108.9 nM，能够显著降解HDAC VI，以及减少 IL-1β（白细胞介素-1β）的释放和p20（caspase-1的中间体片段）的产生；体内研究表明，化合物2降低IL-1β水平，而不影响TNF- α（肿瘤坏死因子-α）水平。

Compound3：Yang等人合成的PROTAC分子，以来那度胺作为配体与CRBN（E3连接酶配体）结合，DC₅₀为1.9 nM，显著降解HDAC VI。

 图3 靶向HDAC VI的PROTACs

2 IRAK3/4（IL-1受体相关激酶）

IRAK（Interleukin-1 receptor-associated kinase）是与IL-1R和Toll样受体（TLR）信号传导相关的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。IRAK家族成员通过激活下游的信号转导分子如NF-κB和MAPK途径，在调节炎症反应和免疫反应中起着关键作用。其中IRAK-4尤其重要，因为它是固有免疫系统中IL-1家族和TLR家族信号通路交汇的关键节点，参与全身炎症反应的调控。IRAK4蛋白涉及类风湿关节炎和化脓性汗腺炎（HS），是目前治疗免疫疾病的深入研究课题。由于IRAK1和IRAK4的ATP结合位点之间的高度相似性，IRAK4的选择性抑制剂或可治疗系统性红斑狼疮。

Compound5、6：Kargbo等认为，PROTAC可以克服IRAK4蛋白的催化结构域高度保守的限制，开发的化合物5、6可有效降解IRAK4，IC₅₀和DC₅₀值低于30 nM。

Compound7、8：Nunes等人使用异喹啉弹头（IRAK4抑制剂）和各种E3配体，如VHL（VonHippel-Lindau）、CRBN或IAP（凋亡抑制剂蛋白）。其中，含有氟基团的化合物7的DC₅₀为259 nM。进一步细化结构，化合物8采用螺旋环嘧啶连接子，比柔性的线性碳链更具刚性和极性，DC₅₀为151 nM。

Compound9：Chen等人研究发现，采用更短长度连接子的PROTACs并没有观察到IRAK4的显著降解，而含有PEG（聚乙二醇）连接子的化合物9可以有效地降低IRAK4的水平。

Compound10：Zhang等人，将环丙基作为连接子偶联位点，化合物10抑制了IL-6的产生；接着改变连接子，合成一系列PROTACs，其中化合物10b和10d的DC₅₀值为190 nM和405 nM。

Compound11、12：Degorce等人在研究IRAK4蛋白时，偶然发现IRAK3抑制剂治疗自免疾病的功效。POI配体采用吡咯三嗪的顺式异构体，E3连接酶配体采用VHL或CRBN。研究表明，含有PEG连接子的CRBN比VHL具有更好的降解能力，且在采用CRBN的情况下，连接子的长度与降解效果成正比。化合物11和12选择性降解IRAK3，DC₅₀分别为0.052 μM和0.002 μM，Dmax分别为74%和98%。

Compound13：Rowley等人也做出了类似的努力，他们研究了IRAK3蛋白来控制树突状细胞介导的IL-12。采用克唑替尼作为POI配体，VHL作为E3连接酶配体，反式环己酰胺作为连接子，化合物13能够有效降解IRAK3，DC50为94 nM和 Dmax为95%。用化合物13处理树突状细胞后，无论LPS（脂多糖）存不存在，IRAK3均被降解，同时在LPS刺激下，IL-12p水平显著升高。

图4 靶向IRAK3/4的PROTACs

3 PCAF和GCN5（p300/cbp相关因子和组蛋白乙酰转移酶）

PCAF和GCN5是密切相关的表观遗传蛋白，在多种细胞通路中调节免疫功能。阻断PCAF和GCN5治疗自身免疫性疾病的机制是通过，减少H3K18、H3K9乙酰化， 抑制NF-κB，IFN-β，TBK1过表达，调节炎症免疫信号。

Compound14：Bassi等人采用PCAF和GCN5的活性抑制剂GSK 4027作为POI配体，采用CRBN作为E3连接酶配体，化合物14能够有效降解PCAF和GCN5，DC₅₀分别为1.5 nM，3 nM。在10 min内，浓度为30 nM的化合物14能使蛋白降解80%。 

图5 靶向PCAF/GCN5的PROTACs

4 JAK/STAT（Janus激酶信号转导因子/转录激活因子）

JAK/STAT通路是一种重要的细胞内信号传导途径，细胞因子与JAK受体结合，启动STAT转磷酸化，导致增殖和分化等活性的基因表达，引发多种疾病，如类风湿性关节炎（RA）、阿尔茨海默病（AD）、炎症性肠病（IBD）和多发性硬化症（MS）。JAK抑制剂，如Tofacitinib、Ruxolitinib、Baricitinib等，通过调节T细胞活化和自然杀伤（NK）细胞活性，改善类风湿性关节炎。

尽管JAK/STAT靶点已经发现了几十年，但其开发仍存在挑战，如药物半衰期短、血栓栓塞等副作用以及JAK/STAT通路和非典型信号转导之间的串扰。PROTACs可能是破局之选。

Compound21-26：Shah等人，以嘧啶和喹恶啉核作为POI配体。其中，喹恶啉基序的细胞渗透性优于嘧啶基序，且对JAK2具有更高的选择性，已证明6个PROTACs具有降解JAK1和JAK2的作用。

Compound28-30：Kargbo等人发现化合物28的EC₅₀为0.0002 μM，进一步设计了含有Ruxolitinib、Baricitinib（强效JAK抑制剂）的化学物29和30，EC₅₀分别为0.00054 μM和0.0039 μM。

图6 靶向JAK/STAT的PROTACs

5 RIPK2（受体相互作用蛋白激酶2）

RIPK2是一种在细胞内信号传导中起关键作用的激酶，参与调节细胞的固有免疫、适应性免疫以及凋亡过程。RIPK2的过度激活和功能失调可导致多种炎症性疾病、自身免疫疾病、癌症以及神经系统疾病。到目前为止，由于泛抑制作用，还没有可用于临床的RIPK2抑制剂。

Compound32-34：Mares等人开发了化合物32，pDC₅₀（DC₅₀的负对数）为9.4± 0.2，但溶解度较差。进一步，通过添加非亲脂性基团来提高溶解度，合成化合物33，pDC₅₀为7.9。进一步，为了解决大剂量依赖性，所合成的化合物34，效力增加了10倍，pIC₅₀为8.0。

Compound35：Bondeson等人开发的化合物35，DC₅₀为1.4 nM，Dmax为95%。

图7 靶向RIPK2的PROTACs

6 STING（人体干扰素基因刺激因子）

STING是一种在固有免疫反应中起关键作用的信号转导分子，被来自病原体和宿主细胞质DNA激活后，激活促炎介质，如细胞因子和IFNs的释放来对抗细菌感染。

Compound45-50：Liu等设计了PROTACs来靶向STING途径治疗各种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮。POI配体为C-170 STING抑制剂，E3连接酶配体为为CRBN，合成连接子长度不同的化合物45-50。其中，化合物47显示出最令人满意的结果，DC₅₀值为3.2 μM。在小鼠肾脏组织中的体内研究表明，化合物47可以以剂量依赖的方式降低IFNβ、IL-6和CXCL-10的水平。 

图8 靶向STING的PROTACs

7 MIF（巨噬细胞迁移抑制因子）

虽然MIF以其抗癌潜力而闻名，但它也与免疫反应有关。

Compound51-56：在Xiao等人开发的，以7-羟基香豆素和7-羟基-3,4-二氢苯并恶嗪-2-1核为POI配体，以CRBN为E3连接酶配体的化合物51-56中，化合物54表现最优，在2 μM时，与MIF的Ki值为71%，MIF在A549细胞中降解率为71%。

图9 靶向MIF的PROTACs

8 IKZF（Ikaros锌指转录因子）

IKZF对免疫调节活性至关重要，其基因的多态性可导致系统性红斑狼疮。

Compound57、58：化合物57和58与CRBN-DDB1（DNA损伤结合蛋白-1）复合物属于强结合，KD值小于10 μM。

图10 靶向IKZF的PROTACs

  小结  

PROTACs在探索自身免疫性疾病等靶点方面具有良好的体外效力。在理想情况下，研究人员希望获得高Dmax值（例如大于90%的降解效率）和低DC50值，这意味着PROTAC分子在较低浓度下就能实现高效的蛋白降解，预示着更好的治疗效果和更低的副作用。通过优化PROTAC分子的设计，包括选择合适的靶蛋白（POI）配体、E3连接酶配体和连接子（linker），提高了PROTAC分子的疗效和选择性，有望成功将PROTACs带入自免治疗的临床阶段。

具体的设计有考虑到：①优化连接子长度以稳定三元配合物；②添加非亲脂性基团以增加溶解度；③POI配体只留下结合部位，其余修改为连接子，减少额外的毒性；④借助BioPROTACs和杂交PROTACs的研究进展，找到缺乏配体结合位点的POI的解决方案；⑤通过口服/静脉注射纳米制剂，持续递送药物，延长半衰期。

参考资料：

https://doi.org/10.1039/D4MD00142G

10.12日，深圳；BiG第二届自免研讨会

8:50-8:55 领导致辞

8:55-9:00 联合主办方致辞

涂   欢：深圳医学科学院副院长、深圳湾实验室副主任

9:00-9:30 临床视角，创新药开发自免，如何选择适应症？

徐沪济：海军军医大学长征医院大内科主任兼风湿科主任/清华大学医学院教授

9:30-10:00 药厂视角，自免布局和BD策略

10:00-10:30 MNC视角，AZ在肿瘤+自免的布局和开发策略

章   宇： 阿斯利康产品管线和项目管理副总裁

10:30-11:30 Panel：自免创新药如何立项？MNC&biotech的布局策略，BD合作背后的故事？

肖昌春：赛诺菲中国研究负责人、赛诺菲研究院负责人

徐亚南：武田制药全球外部创新合作部中国区负责人

靳照宇：明济生物董事长兼CEO

朱向阳：华奥泰生物总经理

周潇薇：松禾资本董事总经理（主持）

11:30-12:30 Panel：从肿瘤转战自免，创新疗法（CAR-T/CAR- NK/双抗/ADC/PROTAC等）如何选择适应症，不同modality各自开发优势及挑战，在哪里？未来有哪些新靶标值得关注？

范晓虎：湾岛细胞创始人/CEO

王立群：星奕昂生物创始人、董事长兼CEO

花海清：映恩生物研发副总裁

冯    焱：领泰生物创始人/CEO

张   雷：深圳湾实验室特聘研究员

卢宏韬：科望医药联合创始人/CSO、BiG总干事（主持）

12:30-14:00 午餐&参观&自由交流

● 深圳医学科学院（SMART）、卫光生命科学园、湾有引力

14:00  论坛闭幕

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