科研 | 华农: 定量蛋白质组学分析揭示酯环化酶UvEC1在水稻假黑穗病病原体稻曲病菌致病性中的作用（国人佳作）

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编译：微科盟吴悠，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

水稻假黑穗病是由稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)引起的世界性真菌病害。在这项研究中，作者鉴定出一个拟酯环化酶蛋白（命名为UvEC1）在稻曲病菌感染期间受到显著上调。UvEC1中含有一个类似SnoaL的聚酮环化酶结构域，但其在植物真菌病原体中的功能尚不清楚。UvEC1缺失导致营养生长和分生孢子缺陷。UvEC1对于高渗和氧化应激的反应以及细胞壁完整性的维持也是必需的。重要的是，∆UvEC1突变体的毒性降低。作者进行了基于串联质标记(TMT)的定量蛋白质组学分析，以鉴定∆UvEC1-1突变体和野生型分离物HWD-2之间的DAPs(DAPs)。蛋白质组学数据显示UvEC1对代谢、蛋白定位、催化活性、结合、毒素生物合成和剪接体有多种影响。综上所述，研究结果表明UvEC1对病毒的发育和毒性至关重要。

论文ID

原名：Quantitative Proteomics Analysis Reveals the Function of the Putative Ester Cyclase UvEC1 in the Pathogenicity of the Rice False Smut Fungus Ustilaginoidea virens译名：定量蛋白质组学分析揭示酯环化酶UvEC1在水稻假黑穗病病原体稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病性中的作用
期刊：International Journal of Molecular ScienceIF：5.923发表时间：2021.04通讯作者：黄俊斌
通讯作者单位：华中农业大学植物科学技术学院

实验设计

实验结果

1. 稻曲病菌中UvEC1的鉴定和特征分析
在感染水稻小穗的稻曲病菌的RNA-seq数据中，作者发现Uv8b_4649基因在感染过程中显著上调(图S1)，由此推测它可能参与了稻曲病菌的致病过程。Uv8b_4649 (GenBank ID KDB14378.1)是一种酯环化酶，由一个402bp的开放阅读框组成，编码133个氨基酸的蛋白。编码的蛋白质含有一个聚酮环化酶SnoaL结构域，位于氨基酸7-127之间。作者利用SnoaL保守结构域序列在NCBI数据库中对其同源蛋白进行BLASTP搜索，在其他真菌中发现了与UvEC1高度相似的蛋白，包括 Hirsutella mintensis (69.84%)、Scytalidium lignicola (66.4%)、Cordyceps sp.RAO (66.14%)和Ophiocordyceps sinensis (65.57%)(图1a)。多重氨基酸序列比对显示，它们具有一个保守的酮环化酶SnoaL结构域(图1b)。根据BLASTP分析，EC1同源蛋白在细菌和少数真菌中具有特异性分布。图1 稻曲病菌（U. virens）中UvEC1的生信特征分析
a，利用MEGA 7.0软件 NJ法生成的5个真菌基因组编码的假定EC1同源基因的进化树。每个分支节点上的数目代表1000次重复所占的百分比。b, H.mintensis、S.lignicola、Cordyceps、O.sinensis中EC1同源蛋白氨基酸序列的多重比对。
2. 稻曲病菌中UvEC1的基因组缺失和互补分析
为了研究UvEC1在稻曲病菌中的生物学功能，作者通过同源重组将UvEC1基因敲除(图2a)。从UvEC1敲除文库中，作者通过基因组PCR鉴定了两个具有相似表型的独立缺失突变体(图2b,c)。通过RT-PCR和Southernblot分析验证了其为假定的UvEC1基因缺失突变体(∆UvEC1-1和∆UvEC1-18)(图2d,e)。如图所示，RT-PCR结果显示UvEC1仅在野生型菌株HWD-2中表达，而在任何一个敲除突变株中均不表达(图2d)。同样，Southern blot分析显示UvEC1敲除突变体中有一个5.8 kb的条带，比HWD-2中检测到的条带(7.3 kb)短(图2e)。为了确定UvEC1缺失突变体中观察到的表型是否可以通过重新引入野生型的UvEC1拷贝来恢复，作者还在∆UvEC1-1突变体背景中创建了一个互补系。因此，作者引入了一个UvEC1-GFP结构，通过农杆菌介导的转化，置于野生型UvEC1启动子的控制下。通过RT-PCR分析UvEC1转录水平，作者确认了其为互补菌株C∆UvEC1-1(图2e)。因此，作者鉴定了野生型菌株HWD-2，缺失突变体∆UvEC1-1和∆UvEC1-18以及互补菌株C∆UvEC1-1的相关表型。图2 UvEC1基因的缺失与互补
a,UvEC1的基因敲除和互补示意图。b-d,UvEC1突变菌株和互补菌株的RT-PCR表达分析。e,对HWD-2和ΔUvEC1突变体进行Southern blot分析。
3. UvEC1缺失影响稻曲病菌的营养生长和孢子分生
与野生型菌株HWD-2相比，∆UvEC1突变体的菌丝生长速度明显加快(图3a,b)，尽管显微镜下的菌丝形态检查显示，∆UvEC1突变体与HWD-2之间没有显著差异。与野生型菌株相比，∆UvEC1突变体的分生孢子数目显著增加，但突变体分生孢子形态正常(图3c,d)。这些结果表明UvEC1在稻曲病菌的营养生长和孢子分生中起着重要作用。图3 UvEC1的缺失影响了稻曲病菌的营养生长和孢子分生
a,野生型HWD-2、∆UvEC1突变体和互补菌株在马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基上28℃黑暗培养14天后的菌落形态。b,菌株菌落的平均直径如图a所示。c,野生型HWD-2、∆UvEC1突变体和互补菌株在马铃薯蔗糖牛肉液体(PSB)培养基中28℃、180 rpm振荡培养7天的平均分生孢子产量。d,野生型HWD-2、∆UvEC1突变体和互补菌株的分生孢子形态。
4. UvEC1对多种胁迫响应十分重要
为了评估UvEC1在介导稻曲病菌引起的形态发生或致病相关胁迫的适应中的作用，作者比较了WT、∆UvEC1突变体和互补菌株在含有各种胁迫介质的PSA培养基上的径向生长速率。与HWD-2相比，0.3 M NaCl和0.5 M山梨醇显著抑制了∆UvEC1突变体的菌丝生长。同样，渗透胁迫剂严重影响了细胞壁，如0.03% SDS、120μg/mL刚果红(CR)或120μg/mL卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CFW)，显著减缓了∆UvEC1突变体相对于野生型菌株HWD-2的生长(图4a,b)。0.04% H₂O₂处理对菌丝生长无显著抑制作用，尽管大多数菌落生长都受到该处理的显著抑制。作者推测可能使用的浓度对菌落生长有强烈的影响，导致没有出现明显的差异生长抑制。因此，作者用较低剂量的0.02% H₂O₂重复实验，这显著减缓了∆UvEC1突变体相对于野生型HWD-2的菌丝生长速度(图4a,b)。重要的是，所有在∆UvEC1缺失突变体中观察到的生长缺陷都在C∆UvEC1互补菌株中得到了完全修复，这表明UvEC1在应对稻曲病菌氧化应激、渗透应激和细胞壁完整性方面发挥了关键作用。图4 ∆UvEC1突变体对各种胁迫的敏感性
a,HWD-2、UvEC1突变体和互补菌株在含各种胁迫诱导物的PSA培养基上28°C黑暗培养14天后菌落生长状况。b, a所示的胁迫诱导物对菌落生长的抑制率。
5. UvEC1的缺失影响稻曲病菌的致病性
为了研究UvEC1在稻曲病菌致病性中的作用，作者在孕穗期将UvEC1接种于感病品种水稻 (‘Wanxian 98’)的穗上，对所有菌株的致病力进行了测定。在接种后21天(dpi)，作者观察到感染HWD-2、∆UvEC1突变体和互补菌株的水稻小穗上出现黄黑穗病球的典型症状(图5a)。然而，在感染∆UvEC1突变体菌株的植株的小穗数比感染WT或互补菌株的植株中要低得多(图5b)。因此，UvEC1的缺失降低了稻曲病菌的致病性。图5 UvEC1的缺失影响稻曲病菌的致病性
a, 接种后21天(dpi)HWD-2、∆UvEC1突变体和互补菌株在水稻（Wanxian 98）小穗上的致病性测定。左列,整个稻穗;右列，受感染的单个小穗。b,每穗平均黑穗病球数目。
6. UvEC1在稻曲病菌感染过程中高表达
接下来，作者使用RT-qPCR检测了UvEC1在菌株感染过程中的相对表达，使用的样本分别来自1,3,6,9,13和21 dpi的小穗(图6a)。作者发现UvEC1在9 dpi和20 dpi表达量高，在13 dpi下降2～3倍。这些结果表明UvEC1在感染过程中有不同的表达，可能对菌株的致病性有重要影响。图6 UvEC1在稻曲病菌侵染过程中的表达及亚细胞定位
a,通过RT-qPCR检测UvEC1在水稻小穗不同侵染阶段(1-21dpi)的相对表达量。UvEC1表达量计算以β-tubulin为内参基因。b, UvEC1在稻曲病菌中的亚细胞定位。DIC，差分干涉对比;GFP，绿色荧光蛋白；比例尺为10μm。c, c∆UvEC1-1菌株中UvEC1-GFP-CDC11的免疫印迹分析。
7. UvEC1的亚细胞定位
为了明确UvEC1在稻曲病菌中的亚细胞定位，作者对互补菌株C∆UvEC1-1进行激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察，发现菌丝和分生孢子在细胞质中有很强的GFP信号(图6b)。使用GFP抗体对C∆UvEC1-1菌株进行免疫印迹分析，检测到与UvEC1-GFP相对应的66kDa大小的条带，另外还有一条与游离GFP相一致的条带。这一结果表明UvEC1-GFP融合蛋白在该菌株中被部分裂解(图6c)，导致UvEC1在细胞质中有积累。
8.∆UvEC1-1突变体相对于HWD-2的差异积累蛋白组功能富集分析
作者进行了定量蛋白质组学分析，以鉴定HWD-2和∆UvEC1-1突变体之间的差异积累蛋白(DAPs)，根据鉴定选择标准，在三个独立的生物重复中得到一份3967个差异蛋白的列表(表S2)。作者观察到在给定基因型的所有重复中存在高度相关性，证实了数据集较高的精度(图S2a)。通过计算富集肽的质量误差独立验证了数据集的精度。大多数测量的质量误差小于10ppm，表明质谱(MS)数据具有很高的准确性(图S2b)。大多数被鉴定的肽段长度从7到20个氨基酸不等(图S2c)。基于串联质标记(TMT)的定量蛋白质组学，作者将突变体与野生型菌株HWD-2的丰度进行比较，将变化超过1.2倍且p值低于0.05的蛋白视为差异积累蛋白（DAPs）(表S3)。火山图和热图分析显示，∆UvEC1-1突变体中，丰度较高的蛋白有145个，丰度较低的蛋白有88个(图S3a,b)。作者对DAPs进行了亚细胞定位预测，发现在233个DAPs中，大多数定位于细胞质(29.7%)、细胞核(29.0%)、线粒体(7.1%)或质膜(13.8%)，分泌蛋白(13.3%)或定位于过氧化物酶体(7.1%)(图7a)。GO富集分析表明，在生物过程范畴下，DAPs主要与代谢过程、单生物过程和定位相关(图S4)。在分子功能方面，DAPs主要与结合活性、催化活性和转运蛋白活性有关(图S4)。与亚细胞定位预测一致，从GO细胞组分来看，DAPs主要富集在细胞、细胞器部分、膜和细胞外区域(图S4)。值得注意的是，KEGG通路富集分析显示，剪接体是一个显著富集的功能类别(图7b)。作者基于STRING数据库生成了所有DAPs的蛋白质相互作用网络。DAPs形成了一个高度互联的蛋白质网络。一些复合物和细胞功能建立了突出和高度连接的簇，包括代谢途径、催化活性、细胞对刺激的反应、脂质代谢过程和运输(图7c)。图7 亚细胞定位预测、蛋白-蛋白作用(PPI)和差异积累蛋白(DAPs)功能注释
a,预测DAPs的亚细胞定位。b, DAPs的KEGG通路分析。c,DAPs的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络。
9. UvEC1参与剪接体功能
大多数真核生物的基因表达过程为，前体mRNA (pre-mRNA)通过剪接转化为mRNA，剪接是非编码序列(内含子)被移除，编码序列(外显子)被连接在一起，这是基因表达的一个重要步骤。Pre-mRNA的剪接是由剪接体催化完成的，剪接体是一个由5个小核糖核蛋白RNPs (snRNPs)和许多蛋白质组成的大分子核糖核蛋白(RNP)复合体。依赖于U2的剪接体是由U1、U2、U5和U4/U6 snRNP和多个非snRNP蛋白组装而成的(图8a)。在剪接反应过程中，多种蛋白-核酸复合物和剪接因子以高度精确的顺序组合解聚，形成预组装的复合物U1、U2、U5和U4/U6。在DAPs中，作者鉴定了5个参与剪接体的蛋白:Uv8b_1980 (U5 snRNPs)、Uv8b_3251 (U6 snRNPs)、Uv8b_5686 (U1 snRNPs)、Uv8b_6937 (U2 snRNPs)和Uv8b_7087 (U4 snRNPs)(图8b)。基于RT-qPCR，与野生型HWD-2相比，这些基因在∆UvEC1-1突变体中显示出相对转录水平的改变(图8c)，这些结果表明UvEC1在剪接体中发挥着作用。图8 UvEC1的缺失影响蛋白丰度和剪接体成分的表达
a,稻曲病菌中方的剪接体途径。b, ∆UvEC1-1突变体和野生型HWD-2的剪接体蛋白水平的热图分析。c, RT-qPCR检测∆UvEC1-1突变体和野生型HWD-2中剪接体基因的相对表达。
10.UvEC1与毒素的产生有关
黑穗病菌素(Ustilaginoidin)是稻曲病菌（U. virens）产生的真菌毒素的主要类型之一，对植物、动物和人类都有毒性。Ugs基因家族包含多酮合成酶基因UvPKS1，以及usgO, usgE , usgF等，负责真菌黑穗病菌的生物合成。作者注意到，∆UvEC1-1突变体中几个丰度较高的DAPs参与了毒素的生物合成(图9a)。RT-qPCR分析显示，编码这些蛋白的基因在∆UvEC1-1突变体中的表达量高于野生型HWD-2(图9b)。为了研究黑穗病菌素对水稻种子萌发的抑制作用，作者从野生型HWD-2的PSB培养液、突变体∆UvEC1-1和∆UvEC1-18、互补菌株C∆UvEC1-1中分离了培养滤液。然后，用这些滤液处理水稻种子，并测量芽的生长。∆UvEC1突变体滤液中的水稻幼苗的枝条明显短于WT或C∆UvEC1-1菌株处理的幼苗(图9c,d)。这些结果表明，∆UvEC1缺失突变体可能积累了更多的毒性化合物，限制了水稻幼苗在种子萌发期间的地上部生长。图9 UvEC1缺失影响毒素编码基因的蛋白积累和表达
a,∆UvEC1-1突变体和HWD-2中毒素生物合成相关蛋白水平的热图分析。b, HWD-2和∆UvEC1中毒素生物合成相关基因的RT-qPCR分析。以β-tubulin为内参基因。c,∆UvEC1突变体培养滤液降低了对水稻种子萌发的抑制作用。胚芽长度在生长培养箱28°C光照培养5d后测定。d,用指定培养物的滤液处理的水稻芽的平均长度。将50粒水稻种子移入25 ml培养滤液中，28°C孵育5 d。

讨论

作者通过对稻曲病菌基因组的分析和对稻曲病菌感染水稻进程中的转录组分析，发现了许多与菌株毒力相关的组分因子，其中只有小部分被实验证实。研究其他参与菌株致病机制的基因将加深对其的认识，并为制定更有效的控制策略提供线索。例如，转录因子UvPRO1在稻曲病菌的菌丝生长、孢子分生、胁迫反应和发病过程中起着重要作用，而转录因子UvHox2则调控衣原体孢子的形成、分生孢子和致病性。转录因子UvCom1调控水稻小穗上黑穗病球的形成，UvCom1缺失也显著影响了稻曲病菌的营养生长、分生孢子和胁迫反应。同样地，低亲和铁转运蛋白Uvt3227的沉默导致产孢量减少，致病性增加。Bax抑制剂UvBI-1控制着稻曲病菌的菌丝生长、分生孢子、胁迫反应和致病性。UvAc1和UvPdeH控制细胞内cAMP水平、发育和致病性。UvPmk1和UvCDC2在致病性、菌丝生长、分生孢子和胁迫反应中发挥重要作用。细胞形态发生蛋白UvPal1影响菌丝生长、细胞形态、应激适应和毒力，UvPal1与细胞分裂控制蛋白UvCdc11(又称septin)相互作用，介导septin复合物的形成，维持细胞形态和毒力。自噬8 (Autophagy8,UvAtg8)介导的自噬在稻曲病菌的生长、胁迫反应、有毒化合物的产生、分生孢子、次生孢子的形成和致病性等方面发挥着重要作用。组蛋白去乙酰化酶UvRpd3和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) UvSlt2影响病毒的毒力，两种蛋白相互作用去除UvSlt2上的2-羟基异丁基化和乙酰化标记。在本研究中，作者对假定的酯环化酶UvEC1进行了表征。对EC1同源物的BLASTP搜索发现，EC1特异性分布于细菌和少数真菌中，因为未能识别出其他重要植物病原体(如稻瘟病菌Magnaporthe oryzae, Fusarium graminearum和Botrytiscinerea)基因组中与UvEC1同源的蛋白。UvEC1的缺失显著影响了稻曲病菌的分生孢子、营养生长、致病性和胁迫反应。作者还进行了基于TMT的定量蛋白质组学分析，以确定ΔUvEC1-1突变体和野生型菌株HWD-2之间的DAPs。生物信息学分析表明，几个DAPs参与了代谢、蛋白定位、催化活性、结合和剪接体。许多DAPs是分泌蛋白(图S5)，作者推测UvEC1可能参与分泌蛋白的分泌，而分泌蛋白本身可能在病毒的致病过程中起重要作用。这些分泌蛋白在致病性中的作用有待进一步研究。遗传编码抗性被认为是控制RFS最有效的方法。由于目前尚未发现单一抗RFS的基因或完全免疫的水稻品种，导致水稻假黑穗病难以防治。最近，一种基于RNA干扰(RNAi)的方法被称为宿主诱导基因沉默(HIGS)，以产生抗性品种作为控制真菌疾病的手段，通过转基因宿主植物产生与入侵病原体重要基因相匹配的小干扰RNA (siRNA)，在感染时沉默真菌基因。HIGS因其在抑制病原菌源基因方面具有较高的特异性和效率，已日益成为培育抗病新作物品种的最实用技术之一，例如，针对小麦F. graminearum的毒力基因SGE1、FGP1和STE12, HIGS赋予了小麦(Triticum aestivum)对赤霉病的抗性；同样，编码MAPK激酶的PsFUZ7是调控小麦条锈病病原体Puccinia striiformis f.sp.Tritici(Pst)感染和发育的重要致病因子；PsFUZ7的HIGS对小麦条锈病具有稳定的抗性。大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的HIGS沉默了3个预测致病基因(编码MAPK、亲环素和钙调磷酸酶调节亚基)，抑制了与小麦叶锈病相关的疾病表型。同样，CPK1的HIGS与Pst基因组中的Pst_13661相对应，增强了对条锈病的抗性。显然，开发成功的HIGS策略的关键步骤是识别植物病原体中的有效靶基因。作者认为UvEC1可能是通过HIGS减少或控制水稻假黑穗病发展的合适靶点。综上所述，作者发现UvEC1的缺失影响了菌株的发育和致病性。酯环化酶是一种多酮合成酶，多酮合成酶在稻曲病菌中已报道参与黑穗病菌素生物合成，结果显示UvEC1负调控黑穗病菌素相关合成酶。定量蛋白质组学数据显示UvEC1在代谢、蛋白定位、催化活性、结合、毒素生物合成和剪接体等方面具有多种作用。原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33920773/

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