科研 | 华南农业：比较转录组和蛋白质组学研究为白灵菇子实体采后变质的调控机制提供新思路（国人佳作）
编译：微科盟-Lvpori ，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
导读白灵菇是一种具有高经济效益的食用菌，因其丰富的营养和肉质而广受欢迎。然而，采后迅速变质严重制约了白灵菇的商业推广。本研究通过转录组学和蛋白质组学研究了白灵菇子实体在采后0 h（A）、38 h（B）和76 h（C）的基因和蛋白表达差异，并鉴定出2008条差异表达基因（DEGs），其中265条DEGs与差异表达蛋白（DEPs）注释结果相同。通过GO富集分析发现，DEGs和DEPs的富集模式相似，且主要参与代谢过程。此外，通过比较B/A组和C/A组中DEGs和DEPs所注释到的KEGG通路，发现以漆酶、几丁质酶和β-葡聚糖酶为代表的碳水化合物活性酶存在高表达，其可能直接导致子实体的软化。在C/A组中，1,3-β-葡聚糖合酶的转录因子Rlm1的基因表达显著下调，说明该因子可能参与重要的生理反应。漆酶与苯丙氨酸解氨酶参与子实体前76 h的褐变反应。此外，在基因或蛋白质水平上，糖酵解、脂肪酸降解以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解的几种关键酶显著上调表达，从而能够为TCA循环提供大量的乙酰辅酶A。柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和三种线粒体呼吸复合物通过显著上调从而增强呼吸并产生高浓度的ROS。在ROS清除系统中，只有Mn-SOD在基因水平上显著上调，其可能与Hsp60互作，在抗氧化系统中发挥主导作用。综上，本研究发现采后白灵菇子实体受到细胞壁软化、能量消耗和氧化损伤三种类型的胁迫作用，进而导致细胞周期阻滞和基因表达紊乱。
论文ID
原名：Comparative transcriptome and proteome provide new insights into the regulatory mechanisms of the postharvest deterioration of Pleurotus tuoliensis fruitbodies during storage译名：比较转录组和蛋白质组学研究为白灵菇子实体采后变质的调控机制提供新思路期刊：Food Research InternationalIF：6.475发表时间：2021.06通讯作者：郭丽琼 & 林俊芳
通讯作者单位：华南农业大学食品学院
实验设计
实验结果
1. RNA测序数据和从头组装
本研究对9个白灵菇样本进行了转录组测序，过滤掉低质量reads后获得了463,985,008条clean reads，即69.43 Gb数据量，同时还利用Q20和Q30值对样本质量进行评估（表1）。此外，本研究还得到了18,206条unigene，长度为201～16,163 bp，平均长度为1,522 bp，N50值为2,467 bp（表S2）。通过对各样本unigene表达数量计算，发现A、B、C三组共有8,066条unigene，占总unigene数的58.31%。随着采后贮藏时间的延长，单一样本中的unigene数量呈下降趋势：由A组中的1,894条减少到C组的1,300条，即占比比例由13.69%减少到9.40%（图1）。同时，为了验证RNA-seq数据的可靠性，本研究还选择了7条关键基因进行了qRT-PCR验证，发现所有被检测基因的RNA-seq数据与qRT-PCR结果基本匹配（图S1）。
表1. RNA-seq的质量评估
图1. 维恩图展示A组（0 h）、B组（38 h）和C组（76 h）中的unigene数量
2. 差异表达基因筛选
通过比较分析，本研究从B/A组（38 h vs 0 h）中共得到1,048条差异表达基因（DEGs），其中485条上调基因，563条下调基因；从C/A组（76 h vs 0 h）共得到1,425条DEGs，其中657条上调基因，768条下调基因；从B/C组（38 h vs 76 h）中共得到615条DEGs，其中287条上调基因，328条下调基因（图2）。差异表达蛋白（DEPs）数据与此前研究一致（Ye et al., 2020）。
图2. 维恩图展示B/A组（38 h vs. 0 h）、C/A组（76 h vs. 0 h）、B/C组（38 h vs. 76 h）中的DEGs和DEPs
图分为上下两部分，分别表示上调（红色箭头）和下调（绿色箭头）。
3. 差异表达基因和蛋白的联合分析
3.1 DEGs和DEPs的表达模式分析
随采后时间的延长，DEGs与DEPs共表达的数量由82条增加到220条。此外，共有2,008条DEGs和1,307条DEPs在B/A组、C/A组和B/C比较组中分别表达。通过整合所有的DEGs和DEPs，本研究还发现有265个因子在基因和蛋白水平上均受到显著调控，而1743条DEGs和1,042条DEPs在分析中没有重叠（图2）。
随后，本研究对265个因子进行聚类分析，并将其分为4个表达趋势（图3）。亚聚类1中有131个因子，随着采后贮藏时间的延长，其在基因水平上呈下调趋势，不过在蛋白质水平上的下调趋势较小。亚聚类2中有114个因子，随采后贮藏时间的延长，其基因和蛋白质水平均呈上调趋势。亚聚类3有17个因子，其表达趋势与亚聚类1相似，但在基因水平上的下调显著大于亚聚类1。亚聚类4中只有3个因子，其在基因水平上表达呈先上调后下调的趋势，而在蛋白水平上随着采后贮藏时间的延长表达呈逐渐上调的趋势。
图3. 265个因子的聚类分析模式图
横坐标为样本分组，纵坐标为DEGs或DEPs的相对表达水平。每条折线表示一个因子，蓝线表示子簇中所有因子的平均表达式。
3.2 GO聚类分析
为了进一步探究采后白灵菇子实体DEGs和DEPs所参与的生理功能，本研究将得到的基因和蛋白信息进行了GO功能聚类分析。在B/A组和C/A组的三个GO亚类（分子功能、生物过程以及细胞组分）中，DEGs和DEPs的注释大致相同：分子功能类主要涉及结合和催化活性，细胞组分类主要涉及膜和膜部分，生物过程主要涉及代谢过程和细胞过程（图4）。此外，通过比较B/A组和C/A组中富集数量前20的GO注释，研究还发现两组中DEGs数量变化较小，而DEPs数量变化较大，说明蛋白质水平的调控是白灵菇采后随贮藏时间变化的一个响应特征。
图4. B/A组（38 h vs. 0 h）和C/A组（76 h vs. 0 h）中top20的GO条目
3.3 KEGG通路富集分析
联合组学的KEGG通路富集结果显示在显著富集的17条KEGG通路中，有11条是B/A和C/A组所共有的（图5）。这11条通路可分为三类：基因表达过程类的真核生物中剪接体、RNA转运、核糖体生物发生、核糖体；代谢过程类的淀粉和蔗糖代谢，脂肪酸降解，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，嘌呤代谢；胁迫响应类的过氧物酶体、MAPK信号通路和细胞周期（图6）。此外，本研究还讨论了其他三条参与能量代谢和ROS生成的关键通路：三羧酸循环，氧化磷酸化和糖酵解（EMP）/糖质新生。
图5. B/A组（38 h vs. 0 h）和C/A组（76 h vs. 0 h）中top17的KEGG通路
图6. B/A组（38 h vs. 0 h）和C/A组（76 h vs. 0 h）共有的top17条KEGG通路分类
其中11条通路分为3类，另外还包括能量代谢和ROS生成。
3.4 营养消耗与细胞壁软化
白灵菇子实体的光滑质地主要在于其完整的细胞壁和多糖。在没有底物供应的状态下，白灵菇与水果和蔬菜一样，其呼吸作用依赖于体内储存的营养物质。几丁质和β-葡聚糖是真菌细胞壁的两大主要成分，在饥饿胁迫下经常作为底物被消耗。此外，几丁质和β-葡聚糖形成了真菌细胞壁的微纤丝结构，其含量直接影响真菌细胞壁的硬度。在本研究中，水解几丁质的几丁质酶1和几丁质酶2在基因和蛋白水平上均上调，而几丁质合酶1在蛋白水平上下调（表2）。此外，促进子实体软化的木质素降解酶基因和蛋白水平均上调，可水解可溶性淀粉的葡萄糖淀粉酶在基因和蛋白水平上均呈一致的上调趋势。其他的碳水化合物活性酶包括β-葡聚糖酶、纤维素酶、1,4-β-纤维生物糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡聚糖内酯-1,3-α-葡萄糖苷酶、葡聚糖1,3β-葡萄糖苷酶虽然在蛋白水平上上调，但在基因水平上呈现不一致的趋势。总体来说，多糖的降解导致子实体的软化，这与白灵菇采后多糖含量与质地关系的研究一致。
表2. C/A（76 h vs. 0 h）组参与代谢过程的DEPs和DEGs
有标记的箭头表示上调或下调，同表3和表4。
在氨基酸代谢中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解途径中DEGs和DEPs的含量最多，C/A组5条DEGs中有4条上调（图6），其中负责第一步降解的支链氨基酸氨基转移酶基因上调4.18倍（表2）。同时，这5条DEGs中的醛脱氢酶在蛋白和基因水平上均呈一致的上调趋势，而其他4条DEGs中相应蛋白的表达均无显著上调或无变化（表2）。C/A组中15条DEPs均上调（图6），其分别注释到2-氧异戊酸脱氢酶、酰基辅酶A脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶，上调幅度分别为2.31、2.58和3.11倍（表2）。
脂肪酸降解主要通过β氧化产生大量乙酰辅酶A，释放大量能量。C/A组中注释到脂肪酸降解的包括11条DEPs和5条DEGs。这11条DEPs中有10个上调（图6），包括3-酮酰基辅酶A硫代酶1、烯酰辅酶A水合酶、酰基辅酶A氧化酶、Δ3-Δ2-烯酰-辅酶A异构酶和多种脱氢酶。此外，长链脂肪酸-辅酶A连接酶2在蛋白质水平下调0.55倍（表2）。参与脂肪酸和氨基酸代谢的S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶和醛脱氢酶和EMP的基因在B/A组和C/A组中都上调（表2）。参与脂肪酸β-氧化途径最后一步的3-酮乙基-辅酶A硫解酶1和乙酰辅酶A乙酰转移酶A均显著表达，前者在蛋白水平上上调1.61倍，后者在基因水平上上调2.27倍，但在其他分子水平上变化不明显（表2）。
3.5 能量代谢和ROS生成
ATP是生物体中最直接的能量来源，EMP、TCA循环和氧化磷酸化是ATP或GTP的主要产生者。乙酰辅酶A的供应是获得ATP之前所必需的，这可以通过“3.4”部分提到的脂肪酸和氨基酸的代谢来满足，也可以通过EMP途径获得。C/A组EMP途径在蛋白水平上表达上调，醛脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶在基因水平上表达上调，而乙酰辅酶A合成酶在基因水平上上调3.31倍（表3）。
表3. C/A（76 h vs. 0 h）组参与能量代谢和ROS生成的DEPs和DEGs
以乙酰辅酶A开始的TCA循环共注释到8条DEPs和8条DEGs，其中DEPs均上调，而只有1条DEG下调（图6）。TCA循环中的两种限速酶，柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶在蛋白水平上上调。后者在基因水平上表达，与蛋白质水平趋势一致（表3）。两种级联酶为随后的氧化磷酸化提供了大量的氢载体，使其在电子传递链中释放更多的能量。在放电过程中，氢载体会产生高浓度的活性氧ROS。复合物I作为电子传递链的起始场所，是产生ROS最多的地方之一。在本研究中，复合物I、II和IV在基因和蛋白水平上上调。复合物I催化中心的Ndufs2在基因和蛋白水平上均上调（表3）。琥珀酸脱氢酶（泛素酮）的两个亚基分别上调1.98倍和3.28倍。复合物IV（细胞色素c氧化酶）是电子传递链的末端场所，其注释到的DEGs和DEPs也多为上调。氧化磷酸化途径以ATP酶合成ATP结束，ATP酶在基因和蛋白水平上均上调（表3）。
3.6 过氧化物酶体和ROS清除
在C/A组过氧化物酶体途径中，DEGs和DEPs均以上调为主（图6），主要参与过氧化物酶体生物发生、脂肪酸氧化、氨基酸代谢和抗氧化系统。在过氧化物酶体生物发生中，过氧化物酶体可以通过在胞质多核糖体上合成的膜和基质蛋白的翻译后输入，并在原过氧化物酶体的基础上分裂形成子过氧化物酶体来实现生长。基质蛋白的精确运输依赖于过氧化物酶体靶向信号（PTS）在其多肽链上的引导，包括PTS1和PTS2。在本研究中，通过脂肪酸氧化和氨基酸代谢产生的PTS1型蛋白（ABCD、PECI、PTE、CRAT、IDH）在蛋白水平上表达上调，PECI和IDH在基因水平上表达上调（表4）。基质蛋白的转运依赖于两种PEX（过氧化物酶），PEX5和PEX7，这两种蛋白分别对PTS1和PTS2型蛋白有较高的亲和力。有趣的是，在C/A组中，PEX5是在蛋白质水平下调，而PEX7表达没有明显改变（表4）。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶病膜相关蛋白20（PRDX5）是主要的ROS清除分子，其编码基因和蛋白在C/A组中也显著上调（表4）。
表4. C/A（76 h vs. 0 h）组参与胁迫响应的DEPs和DEGs
值得注意的是，两个分子伴侣Hsp20和Hsp60在蛋白质水平上调（表4），其中Hsp60可以与Mn-SOD产生交互从而帮助后者折叠，导致活性氧的增加。因此，SOD的正常功能依赖于Hsp60的支持。MPV17基因也与过氧化物酶体生物发生中的ROS代谢相关，其在C/A组基因水平下调（表4）。此前研究表明贮藏前3天CAT和SOD活性增强，但是SOD、CAT和PRDX5在蛋白水平上没有变化；天然抗氧化剂EGT含量下降不显著，但从第3天到第6天含量迅速下降。综上，本研究认为采后76 h后子实体的抗氧化活性主要取决于过氧化物酶体的抗氧化系统。当活性氧过量时，EGT也会大量参与抗氧化活性，而酶清除剂无法完全应对过量的ROS。过氧化物酶体膜蛋白27（PMP27，PEX11p）驱动过氧化物酶体分裂和生物发生，其在C/A组蛋白水平上上调（表4）。下调的PEX5蛋白会导致过氧化物酶体的不完全从头组装，从而影响SOD、CAT、PRDX5等PTS1型蛋白进入囊泡。此前的研究表明PEX5基因的下调会引发一系列的生理紊乱，如过氧化物酶体代谢紊乱和线粒体超微结构的改变，这些现象都与本研究中的白灵菇子实体结果非常相似。
3.7 子实体褐变效应
酶促褐变会使白灵菇商品价值严重贬值甚至无法销售。两种PPOs（多酚氧化酶），酪氨酸酶和漆酶，通过催化酚类化合物氧化形成醌，诱导褐变效应。25℃条件下，PPO与白灵菇子实体褐变的相关系数均为显著正相关（R2 > 0.9）。通过对双孢蘑菇和香菇采后的研究表明，酪氨酸酶活性在短期内增加引发的高浓度黑色素是蘑菇褐变的原因。然而，本研究C/A组中酪氨酸酶在基因和蛋白水平上的下调表明黑色素的产生受到了抑制（表2）。此前研究表明漆酶在香菇的黑色素生成中发挥了重要作用。在C/A组中，苯丙氨酸解氨酶在蛋白质水平上上调（表2），其可以促进苯丙氨酸途径进而增加漆酶水平。因此，本研究认为C/A组中基因和蛋白水平上调的漆酶是导致子实体褐变的主要因素（表2），而ROS在褐变反应中起诱导作用。
3.8 应激信号转导与MAPK途径
MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）是从细胞表面到细胞核的重要信号传递者，而C/A组在MAPK信号通路上注释到9条DEPs（仅1条上调）（图6）。信号转导级联的激活主要是由细胞壁应激、饥饿引起的。在细胞壁相关的MAPK级联反应中，Rlm1是MPK1下游的转录因子，能够影响细胞壁的合成、维护和重塑，其在C/A组中显著下调（表2和图4）。在饥饿相关的MAPK级联反应中，MAPK激酶Ste7通过激活两个MAPKs实现交联反应，其在C/A组中也显著下调（表4）。
ROS，以H2O2为代表，可以通过诱导丝氨酸/苏氨酸激酶的表达激活多种MAPKs，如MPK3和MPK6。双特异性蛋白磷酸酶1B可通过与MPK3和MPK6相互作用，对氧化胁迫发挥正调控作用。在本研究中，该蛋白在B/A和C/A组的蛋白水平均下调。此外，PRDX5在过氧化物酶体的抗氧化系统中起着H2O2介导信号的传感器作用，而PRDX5基因表达下调导致机体对H2O2介导信号的敏感性降低（表4）。Hsp20作为热休克蛋白的重要组成部分，可防止蛋白质在分子伴侣中热聚集，调节细胞凋亡过程。B/A组和C/A组的Hsp20在基因和蛋白水平上均上调，C/A组的Hsp60在蛋白水平上均上调（表4），说明机体内ROS的信号转导并没有完全开启。
MAPK信号通路的下游细胞周期涉及纺锤体和DNA损伤检查点，确保细胞周期准确有序的进行。在内源性DNA复制过程中，ROS和代谢副产物或应激反应会引起DNA损伤，这需要DNA损伤检查点来抑制有丝分裂激酶，从而阻止细胞周期在间期或进入有丝分裂。检查点激酶（Chk）缺失或过表达会严重阻碍DNA损伤的修复，从而导致疾病。本研究中，参与细胞周期的DEPs和DEGs几乎都下调（图6），主要出现在S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、纺锤体检查点和DNA损伤检查点。在DNA生物合成途径中，细胞分裂控制蛋白6（CDC6）、起源识别复合物亚基2（Orc2）和DNA复制许可因子MCM7通过相互作用在DNA复制起始和延伸中发挥重要作用，而这些因子在C/A组以及B/A组都显著下调（表4和S5）。因此，综合Ste7在蛋白水平上的下调，本研究认为白灵菇子实体在贮藏76 h后细胞周期出现停滞。
3.9 基因表达受阻
在C/A组基因表达相关的剪切体、核糖体、真核生物核糖体生物发生和RNA运输的4个通路中，共检测到101条DEPs和20条DEGs，其中有5条上调的DEPs，6条上调和14条下调DEGs（图6）。在鉴定的基因和蛋白质中，参与嘌呤代谢的核酸合成关键酶、DNA定向RNA聚合酶I、4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和DNA引物酶都显著下调（表2）。X-DNA能够导致基因组DNA缺失、反复易位和复制异常事件。Crp1p（十字形DNA识别蛋白1）的N末端亚肽可以特异性结合X-DNA，并通过促进X-DNA的裂解来维持DNA的稳定性。此外，RPA2在错配DNA的重新合成中发挥了重要作用。然而，在C/A组中，Crp1p和RPA2在蛋白水平上均显著下调，这与此前双孢蘑菇的研究结果完全相反（补充表S3），说明白灵菇子实体的细胞出现DNA复制错误和损伤，无法形成有效的修复机制。
白灵菇的核酸合成和DNA损伤修复都受到显著抑制，同时其转录和核糖体的生物发生都不能充分发挥作用。snRNP、Prp和EJC/TREX表达下调导致mRNA加工过程受阻（补充表S3）。为了进行新一轮的剪接，催化后的剪接体机制必须通过分解snRNP结合的套索内含子。Prp43是一种ATP依赖的RNA解旋酶，在成熟mRNA释放后参与剪接体的解体，其在基因和蛋白水平中都显著下调。同时，控制RNA和蛋白质转运的NPC蛋白，以及参与随后翻译的eIFs和EJCs的表达均下调（补充表S3）。因此，本研究发现负责翻译的核糖体相关蛋白都显著下调，这在很大程度上解释了基因和蛋白质水平上的调节差异性。
结论
本研究发现碳水化合物活性酶和漆酶的高表达是导致白灵菇子实体在采后变质的主要原因。此外，在基因和蛋白质水平上，参与脂肪酸降解、EMP、TCA循环和氧化磷酸化的各种关键酶表达上调，因此会消耗大量营养物质，同时产生高浓度的ROS。然而，ROS清除系统不足以应对高浓度ROS胁迫，同时漆酶与苯丙氨酸解氨酶参与子实体前76 h的褐变反应。在此基础上，细胞周期障碍会进一步增加复制错误率，而核酸合成和DNA损伤修复等过程都受到抑制，最终导致基因表达受阻（图7）。综上，本研究通过转录组学和蛋白质组学研究，鉴定了多个参与采后白灵菇子实体呼吸、软化、胁迫相关的分子标志物，为采后长期贮藏和选育提供了宝贵的信息。
图7. 白灵菇采后变质机制
实心箭头指向作用于或产生的化合物红色实线表示结果。虚线表示间接反应或PEX55介导的基质蛋白进入过氧化物酶体囊泡。ALDH，醛脱氢酶；ACS，乙酰辅酶A合成酶；ACOX，酰基辅酶A氧化酶；ACADM，乙酰辅酶A脱氢酶；GCDH，戊二酰辅酶A脱氢酶；ECHS，烯酰辅酶A水合酶；ACAA，3-酮乙基-辅酶A硫解酶；ACAT，乙酰辅酶A乙酰转移酶；BCAT，支链氨基酸呢转氨酶；BCKDHA，2-氧异缬氨酰化脱氢酶；HIBADH，3-羟基异丁酸脱氢酶；ACO，乌头酸水合酶；SDH，琥珀酸脱氢酶。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34399517/
----------微科盟更多推荐----------
科研 | 安徽农大：氮调控茶树根中茶氨酸和类黄酮的生物合成:多组学分析揭示的蛋白质水平调控（国人佳作）
科研 | Allergy：桦树、桤木和榛树常见致敏树花粉的比较蛋白质组学
如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取
蛋白质组期待与您交流更多蛋白质组学问题
（联系蛋白组学老师即可申请入群）
请关注下方公众号
了解更多蛋白质组知识
蛋白质组仅用于学术成果分享与交流，不涉及商业利益。
也严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。