综述｜Curr Opin Chem Biol：基于质谱研究新合成蛋白质的最新进展
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导读蛋白质翻译的紧密调控促使蛋白质组在细胞外或细胞内信号的影响下发生变化。尽管基于质谱的蛋白质组学是研究复杂蛋白质组中蛋白质丰度差异的很有优势方法，但分析蛋白质合成和丰度的微小或快速变化仍具有挑战性。嘌呤霉素-质谱结合技术，BONCAT-质谱结合技术和SILAC-质谱结合技术，这些结合了质谱的技术给研究蛋白质合成的扰动、压力或刺激提供了更多的可能。但仍有一定的局限性需要继续改进，我们旨在回顾这一领域当前的进展和最新的一些改进方法。
论文ID
原名：Recent advancements in mass spectrometry–based tools to investigate newly synthesized proteins译名：质谱研究新合成蛋白质的最新进展
期刊：Current Opinion in Chemical BiologyIF：8.822发表时间：2021.8通讯作者：MarcP.Baggelaar
通讯作者单位：分子生物研究中心，荷兰乌得勒支大学；荷兰蛋白组学中心
实验结果
1.背景
蛋白质翻译是基因组和蛋白质组之间的“看门人”，这个步骤过程包括起始、延伸、终止和核糖体再利用。蛋白质合成是与细胞生长密切关联(图1)，在肿瘤细胞蛋白质合成增多，因此抑制蛋白质合成是一种有用的癌症治疗方法。
图1.蛋白质翻译的过程概述
mRNA从细胞核中的DNA转录，然后被运输到细胞质，在那里它被核糖体翻译成蛋白质。tRNA作为mRNA和核糖体之间的连接，通过将mRNA编码的氨基酸呈递到核糖体上，使新生的多肽链延长，生成出新的合成蛋白。
蛋白质合成是很多生理过程的基础，如如学习和记忆的形成，T细胞的活化，还有炎症的发生。虽然蛋白质合成的重要性已被公认，但蛋白质合成的定量分析还是具有一定挑战性。通过对RNA测序或对核糖体分析，可以间接推断出蛋白质合成的速率。但是mRNA水平与蛋白质合成的相关性是有限的，因此直接在蛋白质水平上分析蛋白质组随时间的变化或响应应激之后的变化是很有意义的。这篇文章我们回顾了基于质谱(MS)在蛋白质组范围内研究蛋白质合成的最新进展。
1.1 基于质谱（MS）的蛋白组学
高分辨质谱仪的在功能和性能的正在不断进步，这使得蛋白质组研究的深度和精度不断增加。目前，可以平行分析复杂生物样品中的数千种蛋白质及其翻译后修饰（PTMs）。像SILAC和TMTs这种定量技术，让我们可以仅用一个液相色谱仪就可以准确检测蛋白质丰度在不同条件随时间的变化。然而，当蛋白质丰度的变化很微小时，检测难度还是很大，而且这种变化在自下而上的分析中经常被忽视。因此，新合成蛋白(NSPs)的靶向检测是阐明蛋白质合成细微差异的必要条件。所以现在又研发一些结合了MS的新方法来研究蛋白质合成（图2）。
图2.基于质谱的方法去分析研究新合成蛋白质
(a)目前使用的结合MS的方法分为三种：1.嘌呤霉素标记：氨基核苷类抗生素嘌呤霉素(Puro)，它抑制蛋白质合成并结合到NPCs的C端。生物素化和烷基化嘌呤霉素能够富集靶向让NPCs被测量。2.BONCAT方法：BONCAT依赖于蛋氨酸替代品AHA、HPG或ANL来富集NSPs。代谢后CuAAC可用于标记的NSPs以实现富集;3.SILAC方法：SILAC依赖于同位素标记氨基酸的NSPs的代谢标记。该方法不包含富集步骤，但可以通过同位素标记氨基酸的LC-MS/MS检测来识别NSPs。(b)BONCAT与其他定量技术结合，以提高对NSPs分析的准确性，效率和分辨率。QuaNCAT结合了BONCAT和pSILAC，以区分真正的NSPs和假阳性。HILAQ使用稳定同位素标记AHA和非标记AHA对两种不同的条件进行相对定量。MITNCAT(多重同量异位素标记/非标准氨基酸标记)结合了QuaNCAT和TMT多路技术，减少了标记时间，能在短时间内检测出蛋白质合成中的细微变化。
2. 基于嘌呤霉素
嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素，由白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)生产，后用于研究NSPs。嘌呤霉素通过核糖体催化掺入新生多肽链的C端来抑制蛋白质合成，防止多肽链延伸并导致蛋白质翻译过早终止。现在有附加功能的基于嘌呤霉素的试剂的已经被开发，比如荧光团、光笼化基团和放射性标记，这些新发明可以被用在体外和体内中研究蛋白质合成的时空可视化。与放射性标记和荧光显微镜相比，使用基于嘌呤霉素的衍生物与基于MS的蛋白质组学相结合，可以在单个蛋白质水平分辨率下对蛋白质合成进行全蛋白质组分析。
嘌呤霉素的生物素偶联物最近被引入，以促进嘌呤霉素相关的新生链蛋白质组学(PUNCH-P)的研究，PUNCH-P可以用于检测来自细胞或组织的数千种的NSPs，可以监测细胞系中蛋白质合成的细胞周期特异性波动，并且可以绘制整个小鼠大脑的所谓“翻译组”。因为嘌呤霉素-生物素的细胞渗透性较差，所以我们在标记嘌呤霉素-生物素之前需要分离核糖体。相比之下，嘌呤霉素类似物O-炔丙基-嘌呤霉素(OPP)，即与炔偶联的嘌呤霉素，具有细胞渗透性，因此与活细胞标记相容，OPP已被用于分析活的早期红细胞祖细胞中的NSPs。OPP与pSILAC结合使用，OPP是稳定同位素标记的氨基酸在NSPs中的脉冲代谢掺入。pSILAC的加入可以控制富集过程中由非特异性结合物引起的误差，从而更准确对蛋白质合成定量。OPP的细胞渗透性特征是优于PUNCH-P，PUNCH-P中可能会在核糖体分离时丢失。然而，使用OPP延长原位标记时间会导致截短的嘌呤霉素结合肽的积累，并且抑制蛋白质翻译会影响正在研究的细胞过程。为了解决这个问题Tong等人开发了定量OPP标记，这是OPP与TMT标记的组合，可将标记时间大幅缩短至15分钟，并对超过3000个NSPs进行定量。定量OPP标记可以跟踪脂多糖处理后THP-1巨噬细胞蛋白质合成的动态变化。光笼化嘌呤霉素类似物确实存在但尚未用于MS的应用中，这可能为研究蛋白质合成时提供额外的空间分辨率信息。
2.1 基于嘌呤霉素的体内实验
新生肽链中加入嘌呤霉素类似物是一种有效的方法，但这个方法应用在体内还是有一定的挑战性，因为延长的嘌呤霉素孵育时间会由于翻译抑制和截短的嘌呤霉素化肽而产生毒性。之前通过荧光显微镜和蛋白质印迹研究组织和造血干细胞中的蛋白质合成取得了成功，但在体内将嘌呤霉素标记与基于MS的蛋白质组学结合去研究蛋白质合成仍具有一定难度。
3.BONCAT
生物正交非经典氨基酸标记(BONCAT)依赖于非标准氨基酸(NCAAs)在NSPs中的脉冲代谢掺入。NCAA中的炔烃或叠氮化物连接手柄能够与相应基团进行生物正交连接，之后达到富集NSPs的目的。多种L-蛋氨酸类似物已用于BONCAT，例如L-叠氮高丙氨酸(AHA)、L-高丙炔基甘氨酸(HPG)和L-叠氮基亮氨酸(ANL)（图2）。在这些试剂中，AHA是最常用且翻译活性最高的一种，其掺入率比甲硫氨酸低400倍，而HPG的掺入率比甲硫氨酸低500倍，而ANL不能直接掺入野生型细胞，需用一种用于掺入的突变型甲硫氨酸-tRNA合成酶。
BONCAT自2006年作为一种基于MS的测量蛋白质合成的方法推出以来，已被广泛用于研究生理和疾病过程中的蛋白质合成，比如成功被运用在研究肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β依赖性炎症反应、T细胞活化、催产素和神经元中的蛋白质合成，而且BONCAT也成功运用在在秀丽隐杆线虫、斑马鱼和非洲爪蟾活体实验中。BONCAT得到了广泛的认可和成功，但仍然存在一些挑战，因为这种检测不到大约6%的蛋白质组，检测不到的原因是这些蛋白质不包含任何蛋氨酸残基或仅包含从核糖体释放后直接裂解的蛋氨酸。此外，用链霉亲和素富集生物素化蛋白质容易产生不要的结合物，例如内源性生物素化蛋白质，阻碍对NSPs的鉴定。不止如此，因为标记蛋白质的水平通常较低，在使用BONCAT时测量高时间分辨率或低代谢率系统中的蛋白质合成具有挑战性。
3.1 直接检测标记肽
为了解决由于内源性生物素化蛋白的富集和与固定链霉亲和素的非特异性结合而导致错误识别的NSPs问题，可以直接检测含NCAA的肽。使用脱硫生物素、生物素化位点识别技术或直接检测含生物素的标签来检测NCAA标记的肽，随后用LC-MS检测。此外，还引入了一些可以直接检测来自NSPs的BONCAT标记的肽可切割的生物素化合物，炔基化树脂是一种选择。最近也报道了一种专门用于富集AHA标记的胎的方法：PhosID，膦酸端可实现自动Fe3+固定化金属亲和层析富集，最后直接用LC-MS/MS分析标记的肽，这种方法是受到PhoX交联剂富集方法的启发而创造出来的。用HeLa细胞中IFN-γ处理NSPs，一共发现176个NSPs被明显调节，这与Kleinpenning的实验结果一致。
3.2 结合BONCAT与SILAC技术
另一种区分真正的NSPs和非特异性结合剂的策略是结合BONCAT和pSILAC，非常类似于的OPP和pSILAC的组合。BONCAT结合pSILAC进行标记的方法称为定量NCAA标记法(QuaNCAT)，该方法中NCAAs和稳定同位素标记的氨基酸都以脉冲方式代谢并融入细胞，并且已被用于揭示T细胞激活后蛋白质合成的变化。此外，这种方法也被运用于研究海马小鼠脑切片中脑源性神经营养因子诱导的蛋白质合成。重同位素标记的AHA进行定量比QuaNCAT进行定量更灵敏，因为生物素化肽可以通过直接检测含生物素标记方法而被检测的。重标记的AHA现在已经被用于HT22细胞和HEK293T细胞催产过程中表达的NSPs相对定量的实验当中。如果将QuaNCAT与TMT标记相结合，可以在多个时间点（多重同量异位标记/非常规氨基酸标记）对蛋白质合成进行高度多重定量测量。使用这种定量技术，可以在15分钟的时间分辨率下研究表皮生长因子刺激后蛋白质合成的速率。另一项研究将pSILAC，BONCAT和TMT标记相结合，研究了硼替佐米（蛋白酶体抑制剂）或3-甲基腺嘌呤（溶酶体抑制剂）治疗后MCF-7细胞中NSPs的半衰期。这些创新的结合表明了，SILAC与BONCAT相结合的方法能有更高的灵敏度和时间分辨率，更小的误差。
3.3 在具有挑战性的系统中的BONCAT
当前质谱仪的高灵敏可以在低代谢率和低蛋白质合成的系统中成功分析NSPs。BONCAT结合相对/绝对定量的同量异位标记的方法，已经成功地分析了饥饿条件下墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）的蛋白质合成，揭示了分子如何适应压力条件的潜在的机制，并且进一步确定了几种蛋白质表达量的随饥饿时间增加而增加，这几种蛋白质在寄生虫的内质网应激反应中可能起到了关键的作用。这些数据表明，BONCAT能探测寄生虫对外部刺激的反应，更有助于发现寄生虫中的新药物靶点。Van Gelder等人研究了原代海马神经元中代谢型谷氨酸受体激活的蛋白质合成。因此我们可以合理推测，当质谱仪更灵敏的情况下，使用基于BONCAT结合SILAC的方法去研究蛋白质合成更容易实现实验目的。
3.4 细胞型特异性蛋白质合成
与AHA或HPG相比，在基于MS的NSPs分析中，用ANL进行标记提供、保留了更多空间信息，这是因为ANL代谢掺入的先决条件是突变的蛋氨酸-tRNA连接酶的细胞特异性表达去识别ANL。一些研究已经使用了这种技术去监测体内感兴趣的细胞类型，已经有人使用这项技术鉴定了肿瘤特异性蛋白质组。不仅如此，Alvarez-Castelao等人已经证明了使用这种方法还可以研究细胞类型中的合成事件。Castelao和Evans等人在小鼠的海马神经元中对NSPs进行了体内细胞型特异性标记。细胞型特异性NSPs分析是在BONCAT实验中获得空间分辨率的第一步，tRNA合成酶突变体的亚细胞表达能进一步提供合成发生的空间信息。
4．基于动态SILAC的方法
蛋白质水平受蛋白质合成和降解的相互作用而调节。因此，为了全面了解蛋白质动力学，监测蛋白质降解并测量单个蛋白质的半衰期也很重要。与上述技术相比，仅使用pSILAC标记细胞或生物体对所研究的生物系统的侵入性较小。在用同位素标记的氨基酸对非标记蛋白质组进行脉冲标记后，标记蛋白质可以被鉴定为NSPs，并且非标记蛋白质的同时减少与蛋白质降解成正比。pSILAC能实现在体外和体内同时监测蛋白质合成和降解，称为“动态SILAC”（图3）。这种方法的一个缺点是无法富集这些同位素标记的蛋白质或肽。因此，与基于BONCAT或嘌呤霉素的方法相比，需要更长的标记时间，因此，用这种方法监测快速的合成和降解事件具有一定难度。
图3.基于动态SILAC的方法
动态SILAC使用脉冲SILAC将同位素标记的蛋白质识别为NSPs，未标记的减少与蛋白质降解成正比。多路增强蛋白质动力学(mePROD)和多路蛋白质组动力学分析(mPDP)都是将TMT多路复用与动态SILAC相结合的方法。mePROD还包括一个“重”助推器和“轻”“噪声”通道，用于MS1触发并提高量化的准确性。mPDP通过在每个条件下使用“轻”到“重”和“重”到“轻”的开关在MS1通道中创建信号放大，从而通过各个TMT通道实现对合成和降解的稳健检测和量化。
Dörrbaum等人用动态SILAC来研究药物诱导的原代培养神经元稳态放大或缩小中的蛋白质合成和降解。研究设计包括了稳定同位素标记的内标，这能高精度量化蛋白质合成和降解的微小变化，从而获得了放大或缩小期间神经元中蛋白质动力学的综合概况。此外，pSILAC用于研究神经元损伤和随后的再生轴突再生中蛋白质的翻译，pSILAC在研究非分裂细胞系是是有一定的缺点的，其原因是标记效率是不足的，可能在实验中难以区分受损细胞和对照组。
4.1 结合动态SILAC与同量异位素标记
通过多路增强的蛋白质动力学通过TMT标记增加了多路复用能让我们分析蛋白质合成的急性变化，只要不到100000个细胞和2小时就能检测蛋白质合成的细微差异，信号的放大是通过包含用于MS1触发的同位素标记增强通道实现的（图3）。虽然增强通道能够识别更多的肽，但高水平的增强蛋白质组可能会对定量准确性产生负面作用。多重增强蛋白质动力学用于研究综合应激反应中的eIF2alpha和mTOR-依赖的途径，在实验中有观察到这两种途径之间的相互干扰。Savitski等人结合了动态SILAC和TMT标记，称为“多重蛋白质组动力学分析”，研究了雌激素受体调节剂对MCF-7细胞中蛋白质稳态的影响，并观察到各种调节剂对蛋白质合成和降解的不同影响。以上这些研究证明了将动态SILAC与同量异位素标记相结合，有同时分析蛋白质合成和降解的能力和潜力。
结论
结合MS和稳定同位素标记，亲和富集的已成为研究NSPs的强大工具。这些方法的最新进展，如新的富集策略，以及多种（基于稳定同位素）定量技术的结合，使得在更具挑战性的研究目的中，能用越来越高的精度、时间和空间分辨率去研究NSPs。基于嘌呤霉素的方法、BONCAT和脉冲/动态SILAC目前仍然是用于研究NSPs的核心技术。这些技术都有自己独特的优势和劣势，我们在表1中进行了相应的总结。我们预计该领域将进一步朝着更高的灵敏度、时间分辨率和空间分辨率的方向不断发展，并进一步发展到可以快而好的分析新合成的蛋白质组的程度。由于研究NSPs还可以研究健康和疾病中蛋白质组变化，发现新的治疗靶向的关键，因此进一步开发新的方法是大势所趋的。
表1.对方法的讨论及它们的特性
注：QOT，定量OPP标记；MITNCAT，多重同量异位标记/非常规氨基酸标记；HILAQ，重同位素标记的AHA定量；mPDP，多重蛋白质组动力学分析；MePROD，多重增强的蛋白质动力学。有益的属性用“+”表示，而不利则用“-”表示。“侵入性”描述了该方法对研究的不利影响。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2021.07.001
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