科研(IF:28.547) |蛋白质组成和组织结构的空间定位：基于多重抗体成像的引物(Nat. Methods)
编译：微科盟-三金，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
导读组织和器官由不同的细胞类型组成，必须协同工作才能发挥生理功能。创建这些细胞的高维生物标志物目录的努力主要基于单细胞测序方法，这些方法缺乏理解关键细胞通信和相关结构组织所需的空间背景。为了探测足够深度的原位生物学，最近开发了几种多重蛋白质成像方法。虽然这些技术在免疫标记和检测标签的策略和模式上有所不同，但它们通常利用针对蛋白质生物标志物的抗体来提供复杂组织的详细空间和功能图谱。随着这些有前途的基于抗体的多路复用方法被更广泛地采用，新的框架和考虑因素对于培训未来用户、生成分子工具、验证抗体面板和协调数据集至关重要。从这个角度来看，作者提供必要的资源，获得强大且可重复的成像数据的关键考虑因素，以及来自领域专家和技术开发人员的专业知识。
论文ID
原名：Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging译名：蛋白质组成和组织结构的空间定位：基于多重抗体成像的引物期刊：Nature MethodsIF：28.547发表时间：2021.11通讯作者：Andrea J Radtke、 Sinem K Saka通讯作者单位：美国马里兰州贝塞斯达，NIAID，NIH免疫系统生物学实验室、美国马萨诸塞州波士顿哈佛大学怀斯生物启发工程研究所
实验结果
哺乳动物组织由具有独特功能属性和激活状态的各种细胞组成。许多现有方法如免疫组化（IHC）、免疫荧光、转录组学、质谱和细胞计量学等，通过以单细胞分辨率研究组织和器官系统来捕获这种异质性和复杂性。所有这些方法都代表了空间信息和覆盖深度之间的权衡。基于流动或液滴的单细胞方法，如多参数流式和质量细胞术，单细胞核糖核酸测序（scRNA-seq），以及通过测序对转录组和表位进行细胞索引（CITE-seq）可以定义具有令人难以置信的粒度的独特细胞亚群。这些技术极大地扩展了作者对细胞类型和状态的理解，并为样品或患者的多参数分层提供了新的方法，同时确定了临床研究的潜在靶标。然而，它们通常需要组织解离，并且不能为正常组织中存在的细胞间相互作用提供空间背景，并且在疾病中改变。此外，由于多种因素的组合，这些方法无法检索所有细胞类型，包括但不限于组织内单个细胞类型的解离程序差异，分选过程中的细胞损失以及由于成本或测序深度而导致的低采样。而最近的基于成像或测序的方法以单细胞分辨率探测空间转录组，原位蛋白质检测压倒性地依赖于抗体。因此，抗体一直是几种新的多路复用方法的核心，这些方法允许在蛋白质水平上检测空间细胞组织和组织组成。
这些多重成像技术能够超出传统荧光显微镜（通常<5靶标）的光谱限制，详细询问和表征人体组织中感兴趣的细胞类型（淋巴细胞，基质细胞，结构标记物）。随着通过多重检测的蛋白质生物标志物数量的增加（通常>10-50个参数）（图1a），测定变得越来越复杂。因此，多路复用试剂盒设计、抗体验证和仔细的数据采集需要额外的工作，以避免伪影，同时保持可重复性。未来的分析将需要强大的工作流程，以产生高质量的图像，以及最佳挖掘这些数据所需的计算工具。在这里，作者总结了几种基于多重抗体的成像方法，并概述了样品和定制试剂制备、严格的抗体验证和多重面板构建的策略。然后，作者将讨论围绕成像数据的处理、分析和存储的独特挑战。最后，作者分享了对该领域未来的看法，该观点强调了这些方法的实用性，并为广泛采用此处讨论的方法提供了实用指南。
1. 基于多重抗体的成像方法
基于多重抗体的成像方法可以根据抗体标记模式（如金属标签、荧光团、DNA寡核苷酸条形码或酶）和检测方式（例如质谱、光谱学、荧光或色原沉积）进行分类，每种方法都具有明显的优缺点（图1b）。这些方法的详细说明已在别处讨论过，因此，作者专注于高度多路复用成像实验的实践方面。在这些基于抗体的成像方式中，鉴于试剂和成像系统的广泛可用性，基于荧光的多重成像是最成熟的（图1b）。通常，由于所选荧光团的光谱重叠和标记商业抗体的可用性，荧光实验仅限于在单个成像周期内可视化4-7个抗原。高光谱方法能够收集超出此限制的数据，通过利用具有不同激发和发射光谱的荧光团、先进的仪器以及能够补偿光谱重叠的方法，实现多达21个通道的通道单程多路复用成像。
甚至更高维的数据集也可以通过迭代的多步骤过程（或周期）获得，该过程包括（图1b）（1）使用荧光或寡核苷酸条形码抗体进行免疫标记，（2）直接图像采集（荧光抗体染色材料），或与荧光互补寡核苷酸反应以检测标记抗体的子集，然后进行图像采集，以及（3）荧光团灭活或去除抗体或杂交寡核苷酸探针。该过程通过在每个周期后去除荧光信号来规避光谱重叠。使用迭代染色、成像和漂白/抗体去除方法，例如基于组织的环状免疫荧光（t-CyCIF）、迭代间接免疫荧光成像（4i）、迭代漂白可延长多重性（IBEX）、多表附体制图（MELC）和多重免疫荧光（MxIF、CellDIVE），可以使用具有荧光辅助或荧光偶联原色的现成抗体检测同一组织切片中的>60靶标。实施这些方法的关键考虑因素是由于抗体孵育步骤长而延长的实验时间，表位丢失的可能性，组织降解以及连续循环中不完全的荧光团失活。出于这些原因，必须包括此处概述和前面所述的适当控件。
依赖于抗体DNA条形码的替代方法，例如DNA交换成像（DEI），通过交换反应（免疫SABER）进行信号放大的免疫染色和通过索引进行联合检测（CODEX），通过快速结合/解绑荧光寡核苷酸，实现一步免疫染色和快速顺序条形码读出。虽然这些方法可以在广泛的组织中检测大量靶分子，但它们的实用性在苛刻的固定降低了表位保留或具有高自发荧光的组织中受到限制。如免疫SABER31、免疫信号杂交链式反应和酶促（例如辣根过氧化物酶）或酪氨酸信号放大（TSA）等扩增方法可用于改善信噪比，同时增加低丰度表位的检测。直到最近，TSA方法，如蛋白石IHC1仅限于同时检测6–8个标记物，因为酪胺连接的荧光团在经过几轮抗体去除和扩增后仍与组织结合。尽管如此，最近已经证明，蛋白石IHC的荧光团局限性可以使用硼氢化锂来消除来自几种蛋白石染料的信号，从而为捕获高度固定组织中的高度多路复用图像提供了一种手段。
基于荧光方法的替代方法是基于质谱（MS）的方法，该方法包含可电离金属质量标签（图1b）。这些技术能够使用金属偶联一抗的单一预混液在组织切片中可视化>40生物标志物，并且不需要抗体染色/去除循环。两种最常见的技术是多重离子束成像（MIBI）和成像质量细胞术（IMC），其不同之处在于分别使用离子束或激光进行标签电离。这些基于MS的技术的主要优点是能够同时检测和解析数十种金属同位素标记的抗体，恰如其分地命名为“多合一”。金属离子条形码通过规避自发荧光并结合高仪器质量分辨能力而具有低背景信号。与其他多重方法不同，样品必须是真空稳定的，并且抗体标记不能扩增。然而，MS系统的检测限在阿托莫尔数量级上。无牛血清白蛋白（ BSA ）抗体制剂的可使用性是其与其他螯合或荧光团偶联等需要定制的成像工作流程共享的限制因素。与膨胀金属标记抗体检测试剂盒相关的另一个潜在障碍是获得足够数量的同位素纯镧系元素金属。虽然图像采集发生在一个周期内，但考虑到大视场（(~200px/s或1mm2/2h)时，拍摄速度可能会很慢。最后，迄今为止，与传统荧光显微镜相比，这些仪器的操作稳定性较差，需要更多的专业人员和环境才能有效使用。
其他采用一体化数据收集的光谱方法包括使用受激拉曼散射（SRS）或表面增强拉曼光谱（SERS）等技术的多路复用振动成像。这些方法利用荧光团和不同波长的专用修饰剂的增强振动特征来多路复用20个目标，而不是质量条形码。用于光谱多重成像的样品制备与用于荧光显微镜的样品制备类似，可以在没有真空系统的情况下在各种组织制备物上进行。
除了研究二维（2D）组织外，样品制备和成像的最新进展使整个组织体积（三维，3D）的探索成为可能，从而可以更深入地了解总器官结构，同时允许对稀有细胞进行详细表征，这些细胞经常在薄（5-10μm）组织切片中采样不足。例如，化学清除方法可以应用于将完整的组织和器官转化为坚固，透明的样品，用于未来的抗体染色和成像。重要的是，清除方法必须保持蛋白质和核酸的空间分布，同时保持荧光探针的可渗透性。可以使用几种组织清除选项，例如：透明脂质交换解剖学刚性成像/免疫染色相容性组织水凝胶（CLARITY），清除增强3D（Ce3D），全系统控制化学物质的相互作用时间和动力学（SWITCH），蛋白质组的放大分析（MAP），通过分子内环氧化物键在恶劣条件下稳定以防止降解（SHIELD），纠缠连接增强可拉伸组织水凝胶（ELAST）和蛋白质保留扩增显微镜检查（PRO-ExM）。据报道，清除后，组织适合于抗体染色和随后使用加热，去垢剂去除探针，寡核苷酸探针脱杂，或荧光还原。这为实现更高的多路复用3D成像提供了潜力。由于被分析的组织体积，染色和成像步骤明显长于常规组织学，尽管使用电泳加速抗体转运和光片显微镜使整个小鼠器官能够在一天内染色，并在数小时内成像。总之，这些方法能够对完整组织进行快速和多路复用的3D询问，提供系统级的结构和分子信息。
图1 使用多种基于抗体的多路成像平台获取高含量成像数据
a,通过IBEX方法获得的人肠系膜淋巴结的50倍共聚焦图像。两个区域(生发中心、白色矩形和延髓带、红色矩形)的两到四个标记覆盖图以较高的缩放比例显示。用于概览和放大图像的比例尺分别为500微米和100微米。β-T ubulin 3(β-T UB3)，胶原IV(Coll IV)，纤维连接蛋白(Fio)，层粘连蛋白(Lamin)和波形蛋白(Viment)(来自Radtke等人的原始淋巴结数据集)。b，多路抗体成像的主要方法的图形表示。抗体通常用金属、荧光团或DNA寡核苷酸标记，以互补结合荧光标记的DNA探针。
2. 初步实验注意事项
在选择采用或实施基于多重抗体的工作流程时，作者建议遵循“始终如一”。样品数量，多路复用成像是否将成为概述工作的核心重点，可用预算和分析支持是选择组织空间分析方法时的关键考虑因素（图2a）。如上所述，每种多路复用成像方法都有明显的优点和缺点。因此，有关最终数据要求，可用样品和格式以及现有基础设施的问题必须指导多路复用成像方法的选择（图2b）。同样，创建多路复用成像面板的第一步也是最重要的步骤是确定要解决的科学问题。由于所有多重成像模式都共享创建和验证多重抗体检测试剂盒的过程，因此作者的大部分建议都集中在创建由10-60种抗体组成的经过验证的样本库上（图3）。
图2 在现有工作流程中选择和实施基于抗体的多重成像技术的注意事项
a,开源、商业和核心设施选项可以通过与实施的便利性、初始成本投资、每次实验的成本、灵活性和定制化以及所需专业知识相关的优势和劣势来区分。b，几个因素决定了实施哪种方法:成像数据要求(每个样本需要成像的组织面积、最终图像的分辨率、每个样本成像所需的时间、标记的数量)、样本要求(样本的数量和格式、用于样本的保存方法、组织自体荧光以及是否需要2D或3D体积数据)和基础设施要求(可以利用现有设备的地方、分析所需的生物信息学水平、技术支持以及试剂是否可以购买或必须定制)。不同多重成像技术之间的比较总结在补充测试表1中，并在其他评论中有更详细的描述。
2.1 组织处理
这里描述的基于抗体的多重抗体成像方法与各种组织和样品制备物兼容，包括新鲜冷冻（FF），福尔马林固定或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE，图3）。在决定样品制备方法时，应考虑组织结构的保存，长期储存条件，表位可及性以及多重组织成像的易用性。为此，FFPE工作流程比大多数FF方法更好地保留了整体组织结构和细胞形态。此外，由于增强了保存性与室温储存相容性，大多数临床或档案组织都以FFPE块的形式储存。然而，FFPE保存使许多靶标表位无法进入，由于福尔马林固定而增加自发荧光，并且经常需要抗原回收。与单标记IF/IHC相比，适用于一个表位的抗原检索条件可能与另一个表位不相容，需要对不同的分子使用不同的抗原检索方法，这使得多重检测面板的开发越来越具有挑战性。相比之下，FF组织克服了抗原检索的需求，而是需要立即快速冷冻和超低温储存（<-80°C）以获得最佳组织保存效果。最后，使用1%多聚甲醛和洗涤剂的组织保存方法已被证明可以保存组织结构，通过裂解红细胞来最小化组织自发荧光，并且能够使用大范围抗体进行免疫标记，而无需在各种人和小鼠组织中检索抗原。
图3 多重基于抗体的成像分析的小组开发和验证阶段
分析开发的图形表示
在步骤1中，基于指示的标准选择标记。一些多重方法需要定制的试剂(即直接结合的初级抗体)；更多细节见图4。在步骤2中，单独验证抗体以验证目标特异性。在步骤3中，对整个组进行验证，以确保包含额外的抗体不会影响目标特异性。在步骤4中，收集和分析数据。
2.2 成本
在设计高度多路复用的成像实验时，一个被忽视的考虑因素是总体成本和时间投资，包括试剂，抗体，培训，面板优化，图像采集和数据分析（图3）。最终，在合理化下面描述的增加成本时，每个唯一数据点的成本和上下文多路复用数据的功效可能是有用的指标。例如，单重实验可能花费几百美元，而对于相同数量的组织样本，50个复合体的面板可能花费数千美元。有几个因素导致试剂盒的时间和成本大幅增加，包括试剂盒的复杂性（例如抗体数量、标本类型、样品制备步骤）、靶标表位在多个周期内的稳定性（如适用）、统一免疫标记条件下的抗体相容性和性能，以及为获得最佳结果而进行的迭代试剂盒设计和调整。此外，鉴定和获得候选抗体可能需要数天至数周的时间，并且可能还需要使用直接标签修饰一抗。特别是，对于应用于新组织类型的复杂试剂盒，原位验证可能需要数周甚至数月的时间，其中每种抗体都需要首先在单重实验中进行验证，然后在整个试剂盒中评估性能。并非所有抗体克隆都可能适用于所有多重检测技术，并且每种多路复用技术都需要样品特异性抗体滴定。基于MS的平台甚至更加昂贵，需要专门的成像仪器和昂贵的标记试剂。除原材料外，不同测定和方法的培训要求差异很大，可能会大大增加成本。由于这些方法的周期性，在基于荧光的方法的面板开发上投入的时间比在基于MS的方法上投入的时间更多。然而，随着多路复用方法的商业化并被核心设施采用，时间、培训和优化成本最终将减少。
2.3 目标选择
此外，考虑下游分析要求至关重要：图像配准（例如DAPI或Hoechst33342等核标签），细胞分割（例如强健的核染色和膜染色）和无监督聚类（例如，使用标记组合对离散群体进行表型分析）。通过考虑这些要求，建议将推定标记进行排名并归类为"必需"或"期望"，从而大大加快了整体面板开发。这些信息，以及预算和大致时间表，将确定多路复用成像面板中要包含的标记数量。
标记选择可以由专业知识，现有文献，正交数据集和/或在线资源指导。在建立目标分子清单后，下一步是评估和购买适当的抗体。近年来，已经产生了多个抗体搜索引擎，提供了直观的用户界面，通过引用或基于人工智能的方法来管理抗体克隆。除了识别高度引用的抗体克隆外，这些平台还允许研究人员查询许多相关的搜索领域，例如组织和细胞类型，应用，公司和宿主物种，同时通常提供参考图像。值得注意的是，这些数据库没有提供与多重成像相关的性能详细信息，例如表位稳定性，空间位阻和与其他抗体的相容性。出于这些原因，作者提供了先前使用高内涵成像方法对FF，福尔马林固定和/或FFPE制备的小鼠和人体组织进行验证的抗体克隆列表。此外，最近的一份报告概述了用于对各种人体组织进行高度多路复用成像的组织特异性面板。这些资源可作为创建自定义面板的起点，并可根据多路复用成像方法和感兴趣的问题进行定制。
对于对常规多重成像感兴趣的实验室，作者建议使用可根据需要扩增的成熟抗体创建基础面板。这种方法减少了与抗体验证相关的时间和成本。此外，具有适当质量控制措施的重组单克隆或多克隆抗体可提供最小的批次间差异，使其成为高度多重检测的面板开发的首选。除此之外，优先考虑严格质量控制的杂交瘤衍生单克隆抗体，最后是多克隆抗体。建议对每个供应商批次进行应用和样品特异性测试，以确保无论抗体类型如何的情况下，实验的可重复性。
3.创建自定义试剂
许多低功性IHC和IF方法通过二抗（间接检测）利用一抗检测来实现信号放大。虽然方便，但由于一抗宿主物种和同种型之间的显著重叠，这些间接标记方法通常无法用于获得高度多路复用的数据集。因此，通常需要用能够检测的官能团修饰一抗（图4）。最终，试剂制备策略由成本、材料可用性、技术能力、规模和预期的实验设计所驱动。
抗体标记使用多种偶联方法，每种方法都有明显的优缺点以及几个可调变量，包括但不限于：交联剂化学，交联剂浓度，pH值，修饰剂浓度，反应缓冲液和纯化策略。标记程度和共轭纯度/均质性等因素可能因方法和可调变量而异。通常，偶联化学靶向抗体的赖氨酸，半胱氨酸或聚糖残基（图4），尽管还有其他针对氨基末端的位点定向方法，定义的赖氨酸基团或抗体的片段可结晶（Fc）区域。此外，一些非共价方法依赖于二次亲和试剂（例如抗原结合片段（Fab）结构域，纳米抗体或蛋白质A/G）的预混合进行多重检测。
图4 抗体与用于多重化的修饰物结合的过程
在选择标记化学物质和交联剂之后，工作流程通常包括以下步骤:(1)修饰基团的活化(例如硫醇基团的还原)和缓冲液交换，(2)与交联剂的反应，(3)去除过量的交联剂，和(4)抗体与修饰剂的反应。由于反应通常包括过量的修饰剂，在寡核苷酸条形码修饰剂的情况下，使用缓冲液交换、凝胶过滤或序列导向下拉法，从混合物中任选除去未反应的分子。进一步的纯化可以通过离子交换或尺寸排阻色谱法进行，以除去聚集或降解的分子、剩余的修饰物以及结合不足或结合过度的抗体。虽然纯化的试剂通常会提高质量和性能，但纯化可能会大大降低结合抗体的产量，使得小规模制备不切实际或成本高昂。最终产物及其纯度可以通过SDS-PAGE凝胶上的条带移动来验证，在此可以观察到抗体和修饰物(例如使用考马斯、荧光、Sybr染色或银染色)。虽然交联剂可能会干扰这些吸光度测量值，因此需要进行相应的校正，但是可以使用双肉桂酸测定法(BCA)或分光光度法(例如，纳米滴剂)来确定最终的抗体浓度。至关重要的是，应使用直接检测或二级抗体检测，通过与非偶联抗体的功能比较，重新验证最终产物的一般靶结合特异性(例如通过流式细胞术)和目的分析。
3.1 共轭化学
赖氨酸导向的偶联通常优选常规染料和寡核苷酸条形码，因为它们快速、经济高效、可控且可扩展。典型的IgG具有超过40种暴露在溶剂中的赖氨酸，并且这些残基上的偶联程度可以调整抗体与修饰剂的比例。虽然可优化，但标记不是特异性的位点，并且可能导致与非赖氨酸氨基酸残基的异质共轭和交叉反应。如果关键赖氨酸位于抗体活性位点，修饰可降低表位结合活性。这些因素可能使探针标准化和验证更加困难，尽管最近的出版物描述了特定位点赖氨酸修饰，这可能解决其中一些问题。
或者，半胱氨酸导向的偶联反应也是快速、经济高效、可扩展的，并且优选用于添加金属标签和寡核苷酸条形码。虽然基于半胱氨酸的偶联已被证明可以产生更均匀和可重复的结果，但在典型的IgG上只有12个可用的半胱氨酸位点。除了较低程度的标记外，半胱氨酸残基的接近还可能导致染料彼此偶联，这往往会降低由于淬灭引起的荧光。此外，在与马来酰亚胺-荧光团/螯合剂或交联剂偶联之前，必须用二硫磷脂醇或2-羧乙基膦（tris）轻度还原抗体，这可能会影响抗体的结构和亲和力。
通常，当其他方案失败或寡核苷酸条形码偶联时，多糖定向方法更适用于小规模偶联。平均而言，IgG在重链上含有两个多糖位点。因此，多糖定向偶联是位点特异性的，需要较少的抗体与修饰剂比例的优化，更具可重复性，并避免结合位点失活。不幸的是，该方案通常更长，并且需要酶促反应，这更昂贵且难以扩展。
标准商业抗体制剂可能与偶联化学物质不直接相容，因为它们通常含有叠氮化钠、牛血清白蛋白（BSA）、甘油和/或冷冻保护剂。为了促进偶联，作者建议购买简单缓冲液（如PBS）中的抗体或进行亲和纯化。此外，应保存在PBS或硼酸盐缓冲盐水中。由于每次偶联都会导致抗体丢失，因此建议从50-100μg纯化抗体开始，以产生相当量的产品。尽管共轭过程和方法有很大不同，但作者直观地总结了常用方法（图4）。
3.2 共轭条件
最终，定制抗体试剂的生成和验证是开发基于抗体的多重抗体成像面板的主要瓶颈。与单重实验相比，与多重实验相关的偶联抗体的扩展实验规划和验证增加了成本和工作量。定制共轭还引入了额外的批次间变化，特别是对于学术研究小组中进行的小规模准备工作。虽然商业定制偶联服务和现成的偶联试剂盒使修改定制面板的抗体变得更加容易，但与标准染料、金属和寡核苷酸条形码库偶联的现成一抗的更广泛选择将有助于其得到更广泛的采用。此外，抗体性能经常受到与其偶联的金属标签，荧光团或寡核苷酸条形码的选择的影响。因此，靶向低丰度表位的抗体应不与天然自发荧光重叠的明亮荧光团偶联。同样，先前已针对组织类型验证的金属基团和寡核苷酸序列组合是优选的。在定制偶联后，应通过与未偶联版本进行比较来确认最终抗体偶联物的功能，并使用靶标测定法重新评估（图4）。修饰的抗体还可能需要改变组织阻断和抗体孵育条件，以获得最佳性能。
4.多重抗体检测试剂盒设计与开发
4.1 抗体验证
必须针对每个工作流程验证抗体，因为抗体性能取决于组织类型、保存方法、抗原提取条件、最终抗体浓度、孵育缓冲液和检测方法（图3）。虽然Uhlen等人已经描述了抗体验证的最佳实践，并且之前已被广泛报道，用于基于多重抗体的组织成像，作者建议考虑：（1）抗体靶标的组织和亚细胞位置，（2）阳性和阴性组织对照，（3）天然组织自发荧光和其他类型的背景，（4）标志物相容性（例如抗体之间没有交叉反应或空间位阻），（5）通过单链IF或IHC实验确认抗体特异性和（6）信噪比，特别是对于无法放大的实验。除了这里讨论的抗体特异性搜索引擎之外，定期更新的数据库可以帮助确定标记物的位置和相对丰度。使用这些信息，可以使用适当的组织来验证抗体，并具有有据可查的靶向分子表达。此外，敲除或敲低细胞系或具有不同目标空间表达模式的组织可用于进一步验证抗体的特异性。最后，病理学家可以为抗体染色的特异性提供宝贵的信息，特别是在罕见的临床样本或非典型标志物的情况下，人工染色可能更难辨别。虽然作者在这里提供了用于多路复用的抗体验证的概述，但早期的资源提供了对抗体验证过程的更深入和集中的讨论。为了提高结果的再现性和可信度，作者建议在已发表的工作中包括抗体验证的元数据。
影响抗体性能的另一个考虑因素是天然组织自发荧光，其可能因组织类型、疾病状态、样品制备和固定方法而有很大差异。自发荧光会显著影响标记物的可视化，特别是如果这些标记物未与具有较高信号产量的荧光团或光谱通道配对。因此，即使抗体的靶标特异性得到验证，其有效使用也将取决于与组织自发荧光相比，每个组织中的预期信号，特别是如果标记无法扩增。虽然没有用于控制自发荧光的标准方案，但作者提供了最小化来自常见内源性荧光团的信号的策略，作为该领域的资源。
4.2 全面板验证
这里讨论的许多多重成像方法都采用大量同时或迭代孵育的抗体。因此，一旦建立了所需的标记列表并并完成了抗体特异性验证，就有必要验证整个面板，因为抗体之间可能存在交叉反应性或来自报告者或面板内条形码的光谱重叠需要进行调整（图3）。当多重检测组合中的任何抗体需要抗原检索时，相同的抗原检索方法必须适用于检测组中的所有抗体。因此，将多重检测试剂盒中抗体的特异性与其在单重实验中的性能进行比较至关重要。如果抗体的性能与该单重实验不同，则可能需要进一步调整（例如优化染色或偶联条件，或替代克隆）。
最后，作者建议在抗体的动态范围内滴定抗体，以确定最佳的信噪比，同时限制光谱重叠。初始抗体验证和多重检测面板设计可以在与实验组织相同的对照组织中进行。使用对照组织允许使用经过充分验证的抗体组合保留珍贵样品用于最终图像采集。细胞或组织微阵列（TMA）对于在同一载玻片上定量评估最佳抗体滴定特别有用。TMA，尤其是多器官TMA，也推荐用于验证单个染色轮中多个组织中的抗体特异性。最近，TMA用于验证IMC抗体，并使用AQUA预测与疾病结局相关的生物标志物。一种使用分子定义的隔室以亚细胞分辨率自动测量信号强度的软件。对于循环方法，有必要验证组织形态和靶标表位在每个染色/漂白循环或抗体去除步骤中保持完整。验证方法已在其他地方详细介绍，包括（1）比较单链（串行）和循环（迭代）成像实验中的抗体性能，（2）改变抗体添加的顺序（第一个周期与第四个周期），以及（3）在多个周期内对同一目标进行重新成像。如果观察到抗体免疫原性丧失，作者建议将受影响的抗体更早地置于循环顺序中，用不同的克隆替换，或优化循环条件，使低强度抗体继续进行高强度抗体。
4.3 再现性和数据分析
任何科学方法面临的最大挑战之一涉及已发表结论的可重复性和严谨性。特别是对于基于抗体的方法，在没有严格控制的实验的情况下容易产生可变结果。由于基于多重抗体的实验的复杂性，作者鼓励在已发表的工作中包含详细的验证数据，或者将这些数据作为公开数据集的一部分存放。通过强制和标准化这些过程，作者可以促进适当的数据发布和使用实践，这无疑将提高实验的严谨性和可重复性。共享有效抗体的数据可以共同节省大量时间和资源，但需要广泛的多管齐下的验证和稳定的抗体生产。作者相信，商业产品在未来多路复用方法的采用和高保真使用中起着重要作用。访问具有详细信息（例如最佳浓度、测试抗原检索方案、缓冲液条件、稳定性/储存条件、RRID/克隆信息）的特定应用供应商验证和质量控制数据，生产具有已知序列/表位的单克隆抗体，更广泛的抗体标签选项和灵活的配方（例如偶联兼容缓冲液，冻干产品）将极大地支持该领域。公开可用的数据存储库，如HuBMAP数据门户、HTAN数据门户、人类蛋白质图谱、癌症成像档案馆和图像数据资源，可以用作共享和评估数据的早期域。
另一个很大的可变性来源来自原始成像数据的处理方式和程度。为了便于讨论，作者建议使用可以描述任何多路复用成像集的预定义数据状态。其中许多处理和分割分析可以使用商业，免费软件和实验室构建的软件包的组合来执行。一些使用最广泛的软件包包括Zen（商业和免费软件，蔡司），ImageJ（开源），阿什拉尔（开源），细胞套件（开源），CellProfiler（开源），细胞支持（开源），NAPARI（开源），CODEX Processing and inForm/MAV（commercial，Akoya Biosciences），HALO（commercial，Indica Labs），QUPath（开源），DeepCell （开源），ilastik（开源），Visiopharm TissueAlign/TMA（commercial，Visiopharm），histoCAT（开源），MCMICRO（开源），Squidpy（开源），CytoMAP（开源）和许多其他。还开发了替代的无分割方法，用于使用基于像素的亚细胞特征分配对成像数据进行定量分析，以及形状不规则的肌上皮细胞的分类。
多路复用组织成像实验通常会产生相当大的文件，因为对于用平铺和z-stack扫描的大感兴趣区域，需要多个成像周期。为此，需要具有大量内存、高处理速度、高效显卡、集成存储和多核处理器的工作站或计算机服务器来处理这些大型数据集。通常，处理管道在数据状态级别下工作，并且主要是不同软件包的累积，这些软件包将原始数据转换为已处理和分段的数据。值得注意的是，细胞类型或功能单元注释通常需要结合现场专家（例如病理学家或组织生物学家）的意见，这限制了分配的速度，有时甚至是准确性，因为此类任务不容易自动化。
5.未来方向和挑战
尽管需要付出更复杂的实验设计和彻底的验证，但多重成像实验很重要，并且通常是原位可视化复杂生物系统中不同细胞类型和生理状态的唯一方法。例如，多重成像技术的最新进展允许在单个组织切片中染色60多种抗原；这比在最佳显微镜系统上进行的单次实验高出一个数量级。大多数哺乳动物系统包含数百种不同的细胞类型，这些细胞类型具有基本功能，并受到其空间位置和邻居的调节。重要的是，疾病的形成、进展和治疗反应可能受组织内独特细胞关联的控制。所有这些因素都需要高度多路复用的显微镜方法来了解健康和患病组织的复杂性。在最近的一个例子中，超过50个蛋白质被可视化，以揭示不同的细胞邻域如何协调免疫肿瘤微环境的空间组织并有助于结直肠癌的预后结果。
5.1 扩展功能和覆盖范围
抗体长期以来一直是原位蛋白质检测的支柱，但它们是不完美的工具，需要仔细表征和经验优化，这使得多路复用的实现变得单调乏味。它们是大分子，其扩散、靶标获取和结合对样品制备条件高度敏感，并且关键的生化表征信息，如抗体蛋白序列、稳定性、精确表位或结合动力学，很少可用。重组抗体的广泛可用性，更多的纳米抗体选择以及适配子和工程粘合剂等替代探针有可能使多重抗体检测试剂盒的创建在未来更加高效和降低成本。此外，采用多路复用信号放大方法（如上所述）和更亮的纳米发射器作为常用有机染料的替代品将提高多重实验的检测灵敏度。
预计进一步的改进将包括改进的可重复性，自动化的端到端工作流程，每个实验的标记数量更多，更大的可成像区域以及来自多路复用成像领域以外的灵感。值得注意的是，最近的一项研究结合了天文学的原理，以帮助从基于六重TSA的人类黑色素瘤样本成像测定中收集高质量的数据集。由此产生的工作流程AstroPath为独立于操作员的场选择提供了指南，并为多光谱成像中经常遇到的问题提供了解决方案，包括图像处理伪影，图像分割和分类不当以及由于标记强度变化而导致的批处理效应。重要的是，这些原理可以扩展到这里描述的高内涵成像测定。另一个令人兴奋的开发领域涉及特定细胞类型和亚型的多重图像的计算/自动分割，以实现细胞群的组织范围评估。为此，HuBMAP联盟已投入大量资源来比较现有的细胞分割算法，因为它们能够跨多路复用成像平台和定义的数据处理管道分割膜和细胞核。与描述的许多细胞分割方法相比，作者分割大量功能单元（例如肾脏内的肾小球或心脏中的心室）的能力并不那么先进。虽然单个细胞在功能上很重要，但它们在解剖结构中的主动协调对整体器官功能至关重要。多重显微镜方法是推进该领域的关键，因为通常需要几个标记物来完全定义结构，并且自动化使散装组织能够快速分析。最后，在较厚的体积中有效实施这些分析方法将大大推进器官水平的研究。
5.2 处理数据：标准化、可重复性和存储挑战
虽然增加的参数深度对于理解复杂的哺乳动物系统至关重要，但每个周期或蛋白质生物标志物都提供了额外的数据，通常会导致TB级的原始显微镜图像。因此，传输、存储和共享原始数据面临着相当大的挑战。这些数据集带来了挑战，因为多路复用实验通常需要专有软件，并且随着捕获的循环数，标记和样本的数量而扩展。数据集的庞大规模本身就给存储和处理带来了独特的挑战。例如，10个周期CODEX实验（200个图块、11个z堆栈、×20个物镜）的原始数据为>1.5TB（150GB/个周期，3个探针和DAPI）。许多数据库或数据库不会存储这种规模的数据，且不会给作者或期刊带来相当大的成本，从而阻碍了开放数据共享。压缩、扩展景深和重叠裁剪等处理步骤将大大减小文件大小（使用上述示例约为290GB），但这涉及更改图像，防止其他人使用改进的算法和软件重新处理原始数据。此外，数据分析和处理步骤应透明，以便报告特定于分析的元数据或处理标准，以提高最终数据集的可重复性和可靠性，符合FAIR数据报告标准。HTAN联盟最近为组件提供了详细的指南和参考，以及用于记录多重组织成像元数据的结构化数据库。如果数据集以开放或非专有格式（如OME-tiff或BDV）提供，则数据集最有价值，这样可以自由访问标准化格式的数据集作为替代方案，长期存储或归档解决方案（便宜但速度慢）可用于原始数据（状态0），而更高级别的数据状态则保留在更易于访问的存储解决方案上（更昂贵但更易于访问）。
管理这些大型数据集的挑战因用于获取和处理数据的不同方法和工具而进一步复杂化。要解决这个问题，需要标准化、非专有的格式和通用的基础设施来共享和存放数据。作者看到了采用开放科学文化以及国家或国际资助和管理的大型数据存储库结构的价值，例如HuBMAP数据门户和癌症成像档案。这项工作肯定需要所有利益相关者的努力，包括资助机构，出版商，方法开发人员，将这些方法商业化为硬件，软件和化学产品的生物技术公司以及利用这些资源的科学家。
5.3 从多路复用成像到测序
由于多重成像方法与正交模式（如流式细胞术，CITE-seq，质谱，转录组学和光谱学）相结合，因此使结果数据更接近已建立的“组学”实践至关重要。结合这里讨论的多重抗体建议将改善细胞类型的表征，并可能导致细胞（亚）类型的发现。除了对新发现的独立验证外，这种多模态分析还将能够同时测量单个细胞类型的基因表达和蛋白质产物，并允许更好地了解复杂组织中细胞的生理功能和相互作用伙伴。除了这里介绍的多路复用成像方法外，DBit-Seq等新技术和数字空间剖析提供空间定义的核苷酸条形码集合，并使用测序平台实现多重蛋白质检测。这里描述的最佳实践也在很大程度上适用于这些混合方法，尽管不同的考虑因素可能适用于基于亚细胞采样和测序的靶标检测。
结论
在这里，作者概述了基于多重抗体的成像，整理了关键资源，并概述了规划和执行多重蛋白质检测实验的注意事项，这些实验可以提供创建真正的细胞和组织图谱所需的高度分辨的空间背景。此外，这些方法为细胞-细胞相互作用，信号传导事件，亚细胞定位或蛋白质的翻译修饰提供了直接的见解，并且可以补充解离组织的其他批量测定或单细胞组学分析。通过遵循此处和引用资源中提出的建议，作者的目标是使其他研究人员能够使用最先进的多路复用方法获得高质量的成像数据。我们相信，这本入门书将促进对生物医学研究的重要贡献，并且新兴发现将对更大的科学界产生重大影响。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34811556/
----------微科盟更多推荐----------
综述 | Trends Cancer：基于成像的空间蛋白质组学揭示非遗传细胞异质性
综述 | Trends Pharmacol. Sci.：克罗恩病的蛋白质组学和成像研究：“不可能”盟友的结合
如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取
蛋白质组期待与您交流更多蛋白质组学问题
（联系蛋白组学老师即可投稿，申请入群）
请关注下方公众号
了解更多蛋白质组知识
蛋白质组仅用于学术成果分享与交流，不涉及商业利益。
也严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。