科研 |单细胞和血浆蛋白质组学综合模型预测手术部位并发症：一项前瞻性队列研究(Ann Surg)

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编译：微科盟-红烧大肥鸥，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

本研究的目的是为了确定宿主手术免疫反应的单细胞和血浆蛋白质组学是否能准确识别腹部手术后出现手术部位并发症(SSC))的患者。在接受肠切除术的患者中，多达25%的人会出现SSCs，并引起显著的发病率和经济负担。然而，临床上准确预测SSCs仍然具有挑战性。本研究利用高通量的蛋白质组学技术来全面描述患者对手术的免疫反应，这是识别SSCs的预测性生物学因素的一种有潜力的手段。

本研究纳入了41名接受非癌性肠切除术的患者。我们对术前和术后第一天(POD1)的血液样本采用单细胞质谱流式技术和血浆蛋白质组学相结合的方法进行分析。术后第一天样本的单细胞和血浆蛋白质组数据多模型能够准确地区分有SSC (n=11)和没有SSC的患者(n=30) (AUC = 0.86)。模型特征包括SSC发生之前共同调节的促炎反应(如骨髓细胞中IL-6-和MyD88-信号转导反应和免疫抑制反应(如M-MDSCs和Treg中JAK/STAT信号转导反应)。更重要的是，手术前获得的免疫学数据的分析也产生了一个精确预测SSC的模型(AUC = 0.82)。

本研究通过对患者术后免疫反应和术前免疫状态的多组学分析，揭示了手术并发症发生前的系统免疫特征。我们的结果表明，在围手术期风险评估模式中整合免疫学数据是指导个性化的临床护理的一个合理策略。

论文ID

原名：Integrated Single-Cell and Plasma Proteomic Modeling to Predict Surgical Site Complications A Prospective Cohort Study译名：单细胞和血浆蛋白质组学综合模型预测手术部位并发症：一项前瞻性队列研究期刊：ANNALS OF SURGERY
IF：12.969发表时间：2021.12通讯作者：Brice Gaudilliere通讯作者单位：美国斯坦福大学医学院麻醉学围手术期和疼痛医学系

实验设计

实验结果

1. 受试者特征

41名患者经历了包括肠切除术在内的非癌症腹部手术。11例患者在术后30天内发生SSC，包括手术部位感染(浅表层、深层或器官间隙)或无感染的伤口裂开。发生SSC的患者有较高的BMIs、手术时间和术中出血量。

2. 术后24小时免疫反应的综合模型准确地将患者分为SSC

我们在DOS(麻醉前)和POD1（术后第一天）采集血样，用单细胞质谱流式技术分析样品的可溶性血浆蛋白(血浆蛋白组学)，免疫细胞分布和信号转导反应(血浆单细胞蛋白组学)(图1a,b)。本研究产生了9个数据层(图1c)，包括1个血浆蛋白质组数据层和8个质谱流式细胞术数据层（免疫细胞的频率、内源性细胞内信号传导和6种体外LPS刺激、TNFα、IL-2、4、6的组合、P/I、IFNα 或 IL-1β）。

图1 手术后第一天(POD1)免疫反应的综合模型对有和没有手术部位并发症(SSC)的患者进行分类

(a)在参与研究的41名患者中，11名患者在手术后30天内出现了SSCs，而30名患者没有出现SSCs。(b)分别用脂多糖、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-2、4、6、PMA/离子霉素(P/I)、干扰素（IFN）α、白细胞介素-1β刺激或不刺激手术当日(DOS)和POD1上的全血标本，并用单细胞mass spectrometry仪进行分析；使用Olink多重蛋白质组学平台分析血浆样本血浆样品。(c)在使用堆叠泛化(SG)方法整合所有9个数据层之前，针对单个数据层(血浆蛋白质组、免疫细胞频率、单细胞内源性信号以及对6个体外刺激的信号响应)训练弹性网络(EN)惩罚线性回归模型，以区分有无SSC的患者。(d)使用留一法交叉验证(LOOCV)程序对SG模型输出进行评估，并显示了受试者工作特征(ROC)分析(曲线下面积，AUC=0.86，p=2.5e-04)、中值和模型输出的四分位数范围(p=2.48e-04，双侧Mann-Whitney秩和检验)。(e)描述不同数据层的模型特征之间的相关性弦图(Spearman R>0.5)。数据层使用(a)中的配色方案突出显示。

在SSC出现临床症状之前，我们采用了一种SG预测建模方法来确定是否可以在POD1检测到有或没有SSC患者之间的免疫反应差异。这种方法将各个数据层集成到一个单一的多元模型中。SG模型对患者的分类有较高的准确率 (AUC = 0.86, p = 2.5e-04, SG模型交叉验证值的非配对Mann-Whitney秩和检验，图1d)。为了解释复杂的临床和人口统计学变量，我们对SG模型的交叉验证值进行了事后分析。与不包括SG值的模型相比，建立在SG预测性混杂因素上的广义线性模型有明显更好的拟合(p = 2e-07，拟合间的偏差卡方检验）。当考虑到患者组在年龄、性别、手术方式、手术时间、术前诊断、围手术期使用类固醇或生物治疗(如anti-TNFα治疗)方面的差异时，SG模型仍可预测SSC。

3. SSC形成前的术后第 1 天 (POD1)免疫特征

为了更好地理解高维SG模型的生物学意义，我们使用迭代引导程序，根据个体的SG模型特征对多元SG模型的相对贡献(富集倍数，http://links.lww.com/SLA/D596)进行排序。信息最丰富的血浆和单细胞蛋白质组的特征(倍数>2)被标注在图上(Fig. 1e)，并进一步检查验证。

4. SSC的POD1血浆蛋白质组学特征

我们计算t-分布随机近邻嵌入(t-SNE)布局（layout），以直观地表示POD1上的血浆蛋白组相关网络(图2)。SG模型中排名最高的蛋白为TGFα。TGFα是上皮生长因子家族的一员，促进粘膜细胞增殖，并与吻合口瘘有关，在 SSC患者中升高。POD1模型的其他蛋白质组特征在SSC患者中升高，包括 ADA，可溶性TREM1和LIF。其中ADA是一种参与淋巴细胞增殖和上皮细胞分化的嘌呤代谢途径的蛋白质；可溶性TREM1是炎症刺激时被切割的TREM1受体的外域蛋白，以及LIF是IL-6-family的细胞因子，通过促进成纤维细胞释放促炎介质。相反，SG模型中三种信息最丰富的蛋白质组学特征在SSC患者中减少，包括EIF5A，NT-ProBNP，和KRT19。其中EIF5A是一种与t细胞激活和自噬有关的保守的真核翻译起始因子；NT-ProBNP是一种心肌源性促激素，是脓毒症长期预后的预测因子；KRT19是一种参与上皮细胞分化的细胞骨架蛋白，特别是结肠黏膜的细胞骨架蛋白。

图2 POD1血浆蛋白质组学特征在区分有无SSC患者中的作用

中心：相关网络描述SG模型的血浆蛋白质组特征以区分有无SSC的患者。边缘表示特征之间的相关性(Spearman系数>0.9)。蓝色/橙色节点突出显示与SSC的正/负相关。节点大小反映p值的-log10大小。外围：倍数>2.0的蛋白质组特征在框图中显示。与无SSC患者(黑色)相比，红色组患者的ADA、TGFα、sTREM1和LIF四个特征升高，而KRT19、NT.proBNP、EIF5A三个特征降低。

血浆蛋白质组学结果表明，发生SSC的患者在手术24小时内有过度的促炎反应和上皮细胞功能的改变，这可能在临床检测前就已经发生。该分析仅提供了可溶性蛋白浓度测量的间接证据，不能直接与特定细胞或细胞过程的活性联系在一起。

5. SSC的POD1单细胞蛋白质组学特征

通过对免疫细胞分布和信号传导的评估，我们对预测模型的单细胞蛋白质组特征的检测补充了血浆蛋白质组分析。我们使用一种无监督聚类算法Vopo对单细胞蛋白质组数据集的统计信息进行映射和可视化(图 3)。我们首次使用典型的表面标志物区分了固有和适应性免疫细胞群，然后量化了有无SSC患者之间的细胞频率或功能特征的差异，并投射到单个细胞群上。本研究通过使用传统的门控策略识别免疫细胞亚群，并证实了Vopo聚类图上可视化的主要差异(图3)。

在固有免疫区室中，有无SSC患者在骨髓免疫细胞亚群(包括中性粒细胞、经典单核细胞(cMCs)、单核-髓源性抑制细胞(M-MDSCs)和浆细胞样树突状细胞(pDCs)的频率和信号传导活性存在主要差异（图3）。这些差异在内源性STAT3信号转导反应中尤为显著，SSC患者的内源性STAT3信号转导响应高于对照组。STAT3是一种被大量炎症配体激活的主要转录因子，这些配体包括IL-6细胞因子家族。骨髓细胞亚群中磷酸化STAT3信号的增加与造血干细胞患者血浆中IL-6和LIF水平的增加相相一致，这表明在即将发展成为SCC的患者中，促炎通路的激活更为明显。值得注意的是，在M-MDSCs中pSTAT3信号的增加伴随着这种免疫抑制细胞群的显著扩大。除了基础信号转导活性之外，两组患者对体外刺激的一些固有性信号转导反应也不同。在髓细胞固有的免疫细胞中，与对照组相比， SSC患者的MyD88信号对LPS的响应增大，包括ncMCs中pMAPKAPK2和pERK信号的增加和中性粒细胞中IκB信号的降低。这反映出MyD88通路中NFκB支路的激活。相反，MyD88和JAK/STAT信号对IL-2/4/6或IFNα的响应被抑制。

图3 POD1单细胞蛋白质组学特征区分有无SSC患者

中心：使用VoPo算法对单个核细胞群体进行无监督聚类分析。我们勾画和标记主要的先天免疫细胞和获得性免疫细胞区室。外围：boxplot显示了有(红色)和无(黑色)SSC患者最丰富的单细胞蛋白质组特征(倍数>2.0，由使用门控策略识别的细胞亚群获得)。图中显示了中位数和四分位数范围。

在适应性免疫区室中，有和无SSC患者在 CD4+T 细胞亚群、调节性 T 细胞 (Tregs) 和 B 细胞亚群中的细胞频率和信号反应中存在关键差异。值得注意的是，POD1中SSC患者的Tregs内源性pSTAT5信号增加，而pSTAT5对外部刺激的响应(IL-2/4/6)降低。两组患者之间不太明显的差异包括B细胞和浆细胞对干扰素α的pSTAT6应答增加，TCRCD4+T细胞对IL-1β的pERK1/2应答降低，以及γδ+T细胞频率的降低。

为了补充对POD1模型的生物学解释，我们构建了一个弦图来突出各个数据层的模型特征之间的组间相关性（inter-omic correlations）(图1e, SpearmanR >0.5)。9个数据层之间的相关性包括520个中等相关性(R = 0.5-0.75)和128个强相关性(R = 0.75-1)。我们在单细胞蛋白质组数据集中发现了大多数相关性(94.8%)，而血浆和单细胞蛋白质组之间的组间相关性为5.2%。值得注意的是，sTREM1和LIF是最具有相关性的血浆蛋白质组特征，并与多种单细胞信号传导反应相关，包括ncMC、MDSCs和粒细胞中MyD88对LPS的信号传导反应，以及cMCs、ncMC、MDSCs、粒细胞和Tregs中的基础JAK/STAT3信号传导活性，这与在SSCs患者中观察到的这些血浆和单细胞蛋白质组事件的协同增加是一致的。

总之， SSC患者和非SSC患者之间的手术后促炎和免疫抑制细胞机制之间的复杂相互作用是不同的。血浆蛋白质组和单细胞蛋白质组特征的联合分析突出了POD1 SSC患者中促炎反应更为明显。重要的是，单细胞数据进一步揭示了固有（M-MDSC）和适应性（Treg）免疫抑制细胞反应同时参与的差异。这些结果表明，在有SSC风险的患者中，促炎反应和抗炎反应之间的平衡可能倾向于免疫抑制状态。

6. 术前免疫状态区分有无SSC患者

通过对POD1手术免疫反应的分析，我们确定了将发生SSC的患者和未发生SSC患者的免疫特征，从而体现出对创伤性损伤反应的生物学差异，这可能是导致SSC发病的原因。然而在手术前识别出有SSC风险的患者可能需要更有效的先发制人策略。为了确定术后发生SSC患者的术前免疫状态是否与恢复正常的患者不同，我们将对术前血液样本的免疫数据进行SG算法分析(图4a)。SG模型准确区分了两组患者(AUC = 0.82, p = 1.56e-03, SG模型交叉验证值的非配对Mann-Whitney秩和检验，图4b)。

图4 术前免疫反应的综合建模可对有无SSC患者进行分类

a. 如图1所示，我们将手术前在DOS上收集的血液样本用于单细胞(质谱)和血浆(Olink)分析。b. 合并的单细胞和血浆蛋白质组数据集的SG分析确定了准确区分患有和不患有SSC患者的预测模型(AUC=0.82，p=1.56e03，Mann Whitney秩和检验)。c. 使用bootstrap对DOS模型特征进行排序，并详细检查区分有无SSC患者最具信息量的特征。

我们通过迭代bootstrap程序选择了17个对多变量DOS模型贡献最大的特征(Fig 4c)，包括两种血浆蛋白(ITM2A和TREM1)和15个单细胞蛋白组特征，这两种蛋白在后来发展为SSC的患者中增加。对于固有性免疫区室，IL-2/4/6刺激后，发生SSC患者的pDCs中pSTAT1降低。相反，中性粒细胞内源性prpS6活性升高和抑制因子IκB在LPS反应下降低表明了促炎活性增加。对于适应性免疫区室，发生SCCs患者中的浆细胞频率轻度增加。尽管T辅助细胞2中内源性MAPK/ERK信号活性在SCCs患者中升高，但它们对IL-1β、TNFα或IFNα体外刺激的反应降低。两组患者之间不同的临床和人口统计学变量的混杂分析表明当考虑年龄、BMI、术前诊断、围手术期类固醇的使用、伤口分类、抗肿瘤坏死因子或其他生物疗法或手术治疗时，DOS SG模型的预测能力显著增加。比较具有或不具有SG预测的广义线性模型可以显著提高模型与SG值的拟合(p = 8e-05，卡方检验)。我们评估了SSC患者的模型预测时间和SSC发展时间之间的关系，发现这两种预测模型都没有相关性(POD1模型:R = - 0.37，p值= 0.23；DOS模型:R = - 0.17，p值= -0.62)。综上所述，术前患者蛋白质组和免疫组的多模型分析对于识别发生SSC 风险的患者具有很强的预测潜力。

讨论

我们对腹部手术患者的免疫反应进行了血浆和单细胞蛋白质组学分析，来确定与术后SSC相关的免疫事件。我们评估了多个生物学维度(包括血浆蛋白、免疫细胞组成和细胞内信号传导反应)，来捕捉复杂的生物学相关信息，这些复杂生物学可以将无并发症的患者与发展为SSC的患者区分开来。术前DOS模型的AUC为0.82，POD1模型的AUC为0.86，与包括ACS-NSQIP风险计算器评分在内的其他预后模型相比，模型性能良好。我们对手术前后基于血浆和单细胞免疫事件的分析提供了与 SCC 发展相关的创伤相关免疫机制系统观点。后来发展为 SCC 的患者中出现了两个主要特征：1）促炎性 IL-6R 和 TLR 相关信号反应的加剧和；2）免疫抑制细胞反应的增加，包括固有（M-MDSC）和适应性（Treg）免疫抑制细胞反应。POD1 SG模型的关键组分与先前关于SSC免疫机制的知识能够很好地契合。以前的报道表明，术后早期血浆IL-6浓度升高与术后并发症(包括感染)风险增加相一致。cMCs中STAT3信号活性的增加(被IL-6激活)是与SSC相关的最具信息性的细胞特征之一。类似地，固有骨髓细胞yD88信号对LPS反应的增加与之前的结果相一致，表明对手术部位损伤做出反应的固有免疫细胞的系统激活有助于SSC的发展。因此，局部对炎症的过度免疫反应会在一个强化myd88相关TLR信号、诱导屏障破裂和额外组织损伤的循环中，促进手术部位DAMPs和PAMPs的释放。过度刺激TLR信号可以产生一种内毒素耐受状态，这可能会增加患者对感染的易感性。质谱流式细胞术的单细胞分辨率提供了SSCs发病机制的细胞类型特异性反应的新见解。在术后24小时，M-MDSC中STAT3信号通路的增加和M-MDSC频率的增加是POD1模型的特征之一。该结果与之前对骨科手术患者的研究相一致，这些研究表明MDSCs中STAT3信号与手术恢复的延迟之间存在显著相关性。MDSCs是一种不成熟髓细胞的异质性亚群，具有免疫抑制功能。在先前对创伤和败血症免疫反应的研究中，MDSCs被认为可以抑制适应性免疫系统。在SSC患者中，STAT3信号通路的升高是MDSC增殖和免疫抑制功能所必需的，可以协同促进MDSC的扩张，从而加剧免疫抑制状态。我们还观察到SSC患者中内源性STAT5信号通路的上调。相比之下，SSC的患者中，pSTAT5对IL-2/4/6体外刺激的反应较低，这可能表明更高的内源性pSTAT5信号通路可能阻止进一步的体外激活。在成熟的Tregs中，依赖il2r的STAT5激活对维持FoxP3的表达水平和发挥其免疫抑制功能至关重要。FoxP3表达和Treg谱系特异性转录进一步受到IL-6家族细胞因子LIF的刺激。LIF在诱导Treg发育和成熟中的调节功能表明IL-6家族细胞因子在炎症和创伤中的作用是不明确的。总体而言，过度的内源性 Treg 信号传导可能与过度 MDSC 反应协同，并激活免疫抑制状态，从而抑制SSC患者对侵入性病原体的反应。POD1模型提供了手术诱导的SSC发病机制的重要信息，而DOS SG模型表明通过单细胞和血浆蛋白组分析可以在手术前区分两组患者。DOS SG模型中蛋白质组学特征sTREM1和ITM2A的信息量最大。结果显示，在后来发展为SSC的患者中，sTREM1在DOS和POD1上升高，以前的研究表明在细菌感染和脓毒症患者中sTREM1血浆浓度升高。从机理上看，sTREM1是膜结合TREM1的金属蛋白酶裂解产物。然而，LPS等微生物产物既能增加TREM1的膜表达，又能刺激sTREM133的释放，从而增加sTREM1的血浆浓度。SSC患者sTREM1升高是否与骨髓细胞上的TREM1表达相一致。引起TREM1的功能抑制是一个值得进一步研究的重要问题。ITM2A是DOS模型的另一个蛋白质组学特征，它被PKA-CREB信号上调，并导致自噬体的积累和自溶酶体形成的抑制。有效的自噬对组织分化、细胞周期调节、免疫细胞成熟尤其是Th细胞发育等许多生理功能至关重要。DOS模型的其他信息特征还包括多个固有和适应性细胞亚群的差异，如中性粒细胞、pDCs和Th2细胞。值得注意的是，在SSC患者CD4+T细胞中多种信号传导反应(包括IL-1β、TNFα和IFNα)被抑制，这些细胞在抵御细胞外病原体和组织修复的防御免疫中发挥重要作用。结果表明，手术前患者特异性免疫状态可能增加发生SSC的风险。因此，术前对特异性免疫标记物的评估可能有助于对患者进行风险分类，同时人们可以采用干预措施来降低发生SSC的风险。本研究有一定的局限性。队列中有接受过重大腹部手术的患者。两组患者在已知的SSC危险因素方面存在差异，如BMI、手术时间和失血量(所有这些都在SSC患者中增加)。我们的患者人群包括IBD患者，一些患者正在接受免疫调节治疗，这可能影响了他们对手术的免疫反应。然而后期分析表明，当考虑到这些潜在的混杂变量时，我们的SSC预测模型仍然有效，这表明两个患者组之间的免疫反应差异并不主要是由于这些临床或人口统计学风险因素引起的。尽管如此，未来我们需要在更大的人群中进行更广泛的术前诊断和手术干预的研究，以建立结果的普遍性模型。我们没有评估局部免疫反应，也没有测定患者肠道菌群的差异，这对于确定与SSC相关的局部和系统性免疫事件之间的关系非常重要。这对于接受免疫治疗的IBD患者尤其重要，因为他们的肠道菌群容易发生改变。虽然大规模质谱流式细胞术可以在单细胞水平上同时检测多达50个参数，但该技术需要细胞表面和细胞内标记物的预先选择。未来非靶向转录组学、蛋白质组学或代谢方法的研究，将有助于对创伤后患者炎症、代谢和激素反应更深层次的研究，从而提高预测模型的能力。总之，评估病人发生手术并发症的风险在临床上仍是一个挑战。我们结合单细胞和血浆蛋白质组学对手术后的系统免疫反应进行分析，提供了创伤相关免疫改变的临床相关生物学见解，这些改变发生在SSC发生之前。术前样本中得出的模型表明，人们可以开发出足够强大的预测算法对个体患者进行风险分层。原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34954754/

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