科研 |台湾大学:集成微流控芯片和数据非依赖性采集质谱的流线型单细胞蛋白质组学

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编译：微科盟-红烧大肥鸥，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

单细胞蛋白质组学可以揭示生物过程中的细胞表型异质性和细胞特异性功能网络。在蛋白质组分析研究中，我们提出了一种简化的工作流程，即将微流控芯片用于一体化蛋白质组样品制备和数据独立采集(DIA)质谱(MS)，并将该手段拓展到单细胞水平。蛋白质组学芯片能够在单个设备中实现多路复用和自动化的细胞分离/计数/成像和样品处理。结合基于芯片的样品处理和使用特定质谱数据库的DIA-MS，我们在20个单个哺乳动物细胞中平均鉴定出大约1500个蛋白质。应用chip-DIA工作流程分析粘附性和非粘附性恶性细胞的蛋白质组，我们的蛋白质组数据覆盖了5个数量级的动态范围，并具有良好的重复性和小于16%的缺失值。总而言之，chip-DIA工作流程提供了一体式细胞表征、灵敏度和稳定性分析的能力，以及在未来可以在芯片中添加附加功能，从而为单细胞蛋白质组学的应用奠定基础。

论文ID

原名：Streamlined single-cell proteomics by an integratedmicrofluidic chip and data-independent acquisition mass spectrometry译名：集成微流控芯片和数据非依赖性采集质谱的流线型单细胞蛋白质组学
期刊：Nature CommunicationsIF：14.919发表时间：2022.01通讯作者：Yu-Ju Chen & Hsiung-Lin Tu
通讯作者单位：台湾中央研究院化学研究所&台湾大学化学系

实验设计

实验结果

1. 设计和表征iProChip以及简化的微量蛋白质组学工作流程
为了给数量有限的样品提供一个简化的微量蛋白质组学流水线，我们设计了一个集成蛋白质组学芯片(iProChip)的微流控装置，提供从细胞输入到完成蛋白质组样品处理的一体化功能。iProChip具有两层、上推的几何结构，可通过程序控制的34个阀门进行精确的流体操作，从而为精确系统控制提供自动化方案 (图1a-f)。该芯片由9个单元组成，使多路蛋白质组实验能够同时运行。每个单元包含一个细胞捕获、成像和裂解室，一个蛋白质还原、烷基化和水解容器，以及一个多肽脱盐柱(图1C)。所有装置共用9个进水口和2个出水口，可以同时输送试剂和处理样品，以增加分析通量。细胞捕获器由10、50和100根楔形双柱阵列组成，间隔5 μm，分别在5、8.5和11个nL室中快速捕获细胞(图1E)。我们制造了一个半径为1 mm，高度为100 μm(312 nL)的圆形腔室，以适应整个蛋白质组工作流程，包括细胞裂解、蛋白质还原、烷基化和水解(图1f)。注意，iProChip的计算表面积体积比大于现有的单电池器件，如NanoPOTS，但与基于微型小瓶的工作流程相比，它的表面积仍显著减少了90%以上。对于多肽脱盐，我们通过将反相C18微珠装入带有5 μm滤片的微通道中来制作了一根横截面为200μm× 25μm且长度为2.5cm的柱子，从而实现了在芯片上的多肽脱盐。为了增加蛋白质组的覆盖率，我们采取了一种分析策略，该策略使用Orbitrap质谱仪集成了direct DIA和基于数据库的DIA分析方法。我们利用由不同蛋白质组组成的癌细胞系或免疫细胞，开发了由混合DDA-DIA数据集互补建立的谱图库资源，该资源可以作为数字图谱，从理论上重现DIA数据的m/z和保留时间范围内的所有肽(图1g)。具体而言，我们对由具有不同细胞数量的细胞系构建的谱图库进行测试和优化，以最大限度地增加已鉴定和定量的蛋白质数量。图1 集成蛋白质组学芯片示意图和纳米蛋白质组学的简化工作流程a，集成蛋白质组学芯片(iProChip)的亮场图像，图中显示了细胞捕获室(青色)、反应容器(橙色)、SPE柱(绿色)、样品采集端口(深绿色)和控制层(棕色)。b，iProChip操作的整个系统设置。c，单个操作单元的特写视图。比例尺：300 μm。d，安装在显微镜上的即用型iProChip。e，细胞捕获柱(左)和SPE柱中的C18过滤器(右)的SEM图像。这些图像代表了使用扫描电镜观察到的两个芯片。f，iProChip样品制备的操作程序，包括(1)细胞捕获、成像和计数，(2)细胞裂解，(3)蛋白质水解，(4)脱盐和(5)多肽收集。g，蛋白质组学分析示意图，使用基于数据非依赖性采集的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和谱图库搜索。
在简化工作流程的第一步，细胞捕获效率是使用非小细胞肺癌(NSCLC) PC-9细胞来测定的。使用最佳细胞密度(500个/μL)，每个单元所需的细胞数量 (1-100) 可以在10-60 s内被捕获。单细胞捕集器的平均捕获率分别为100、92±3和89±8%。在对包含 1 (~90%) 和2或3个细胞 (~10%) 的凹槽进行计数后，我们发现所有单元的目标捕获效率达到了100%，本研究将其视为一个可绝对量化的模块，以执行简单和快速的细胞分离(图2a, b)。与独立的细胞分选器相比，这种内置模块提供了简单、快速和高效的细胞隔离。我们还发现使用在 3 psi 下运行的较低细胞密度（25个细胞/μL），这种细胞区室允许在 1和5个细胞水平上精确捕获较少数量的细胞。我们还评估了 iProChip 的细胞捕获能力，以表征细胞使用效率（定义为被捕获细胞的数量/总输入细胞的数量）和 iProChip 操作所需的最小细胞数量。本研究使用共5或10μL细胞溶液(25个细胞/μL)，结果表明，捕获 1-100 个细胞的细胞使用效率范围为4%~44%。接下来，我们试图测试在细胞裂解和蛋白质水解过程中试剂是否可以在封闭容器中有效混合。本研究测试了三种混合方法，包括涡旋、振荡(板式振荡器)和被动扩散。利用成像分析，我们计算相对混合指数(RMI)来评估混合性能。结果表明，涡旋、振荡和扩散混合需要 11、16 和 30 分钟才能达到 75% RMI，这表明所有三种混合策略都足以在反应动力学的几分钟到几小时内适应反应，这符合进行蛋白质组学工作流程的时间(图2 c, d)。虽然发现涡流混合的速度更快，但由于其处理灵活性和足够的反应时间尺度，我们在后续实验中采用了这种振荡混合方式。图2 iProChip 的性能表征a，在 10、50 和 100 个细胞区室中捕获的非小肺癌 PC-9 细胞的亮场图像。右上角：被捕获细胞的放大图像。b，表征独立捕获区室的细胞捕获效率。数据用平均值±SD表示（n = 3）。c，在振荡混合表征过程中装满绿色染料的反应容器的典型时间推移图像。比例尺：300 μm。d，反应容器中混合效率的比较。数据用平均值±SD表示（n = 3）。e，填充有C18微珠的 SPE 柱的亮场图像。右上角：C18 过滤器附近的特写视图。f，SPE柱的脱盐回收率。数据用平均值±SD表示（n = 3）。
小型化设备的另一个集成是芯片上的多肽脱盐模块（图2e）。我们通过处理约10个细胞来评估脱盐的有效性，其中脱盐样品的谱图显示出可重复的多肽离子谱图轮廓，而未脱盐的样品则显示出洗涤剂的色谱峰。脱盐模块的负载能力和多肽回收率（%）显示出从0.125~1 μg的线性相关性，回收率约为89%（图 2f）。假设一个典型的哺乳动物细胞含有200 pg蛋白质，预计脱盐柱的容量可以从大约4000个细胞中捕获多肽。此外，我们通过使有色染料流过C18微珠填充柱来评估由于优先流而导致的损害样品回收。结果表明，9psi是克服优先流的最小流量压力。
2. iProChip与DIA MS的集成
为了在蛋白质组学工作流程中操作 iProChip，我们使用内置细胞捕获器捕获精确数量的细胞，包括 1、5、10、50 和 100 个细胞。通过分配和孵育含有 RapiGest、三(2-羧乙基)膦(TCEP) 和氯乙酰胺 (CAA) 的缓冲液，我们对捕获室中捕获的细胞进行同时处理，该缓冲液特别适用于单管的细胞裂解、蛋白质还原和烷基化以最大程度地减少样品损失。随后在反应容器中蛋白质发生水解和酸化，水解后的多肽通过C18柱进行15分钟的脱盐。在每次实验之前，细胞区室和反应容器都涂有牛血清白蛋白 (BSA)，这可以尽量减少肽的吸附损失。对于后续的液相色谱(LC)-MS/MS 分析，我们优化了单次 DIA-MS 采集参数，包括隔离窗口、分辨率、多肽上样量和LC-MS/MS梯度，以提高少量细胞的蛋白质组学覆盖率。为了利用DIA对低丰度和癌症相关蛋白进行深度分析，我们使用肺癌和人类慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞系构建了高质量的特异性谱图库。包含数千个细胞和单个细胞的大量样品中蛋白质组成和动态范围可能会有所不同，这可能会影响色谱保留时间和DIA采集。因此，我们从各自的细胞类型（即PC-9和MEC-1细胞）构建了大规模（1μg）和小规模（~10个细胞）数据库，并利用它们分析不同数量的细胞。具体来说，我们采用DDA和DIA模式进行批量/稀释处理PC-9和MEC-1中的大型特异性谱图数据库，这些数据库分别由6345个蛋白质（83305个肽）和6261个蛋白质（60335个肽）组成，母离子和蛋白质FDR值为1%。这些大型数据库可用于分析更高数量的细胞（即>10个细胞）。对于较低的输入样本（即5个和单个细胞），我们推断小规模的特异性数据库应该有利于鉴定和定量。为了最大限度地提高单细胞水平的蛋白质组分析灵敏度，我们从通过iProChip处理的10个细胞以及通过批量/稀释处理的约1.5ng（约10个细胞）等分试样构建了小型谱图库，得到2231个蛋白质（14054个肽）和2440个蛋白质组（11720个肽）。为了评价基于DIA的iProChip定量性能，我们系统研究了iProChip处理13-14个PC-9细胞在灵敏度、蛋白质组覆盖和重现性方面的优点，并与传统的DDA方法进行了比较(图3a)。本研究中所有数据集的鉴定和定量分析都是按照严格的统计学标准下进行的，即多肽谱图匹配(PSM)和蛋白质的FDR值设为1%。通过DDA方法，我们在三次重复分析中平均鉴定出869个蛋白组(3280个多肽)。相比之下，使用Spectronaut工具的直接DIA (dirDIA)方法鉴定出了1409个蛋白质(5174个肽段)，而使用大规模PC-9细胞数据库辅助DIA (libDIA)方法鉴定出更多的1874个蛋白质(6929个肽段)。比较dirDIA和基于谱图数据库的结果，libDIA的卓越定量性能可能是因为DIA模式可以更有效地检测低强度的肽离子，并能与数据库中相应的多肽质谱图相匹配。结合互补的dirDIA和libDIA结果，该方法整体鉴定范围进一步扩大到2022个蛋白质(7757多肽)。DIA方法鉴定的蛋白和多肽数量是DDA的2.3倍和2.4倍，因此DIA比DDA方法具有更好的图谱覆盖度(图3a)。这些结果表明，基于dirDIA的LC-MS /MS，辅以dirDIA和libDIA的互补策略提高了iProChip中全自动样品制备的小样本的蛋白质组鉴定覆盖率。图3 PC-9细胞蛋白质组分析的DIA和DDA鉴定范围和定量性能的比较a，使用数据依赖性采集(DDA，浅蓝色)和数据独立采集(DIA，浅绿色)模式，通过三次实验鉴定的蛋白质组和多肽数量的比较。Spectronaut通过基于库的DIA (libDIA)和直接DIA (dirDIA)方法获取和处理单次DIA。b，DDA和DIA鉴定的蛋白质数量重叠图。c，DDA和DIA对定量蛋白质组的变异系数(CV%)分布。d，评估通过DDA和DIA在三次 LC-MS/MS 运行中鉴定和定量的蛋白质的缺失值 (%)。e，基于蛋白丰度等级和肺癌相关蛋白注释的动态范围评估。
为了评估iProChip-DIA工作流程的重现性，我们计算了14个PC-9细胞的三次重复分析之间重叠蛋白质的百分比。结果表明，DIA和DDA分别可重复检测到2022种已鉴定蛋白质中的84.2%和869种已鉴定蛋白质中的71.7%，表明iProChip-DIA方法具有更高的重现性和蛋白质组覆盖率（图3b）。在CV≤20%的可重复性定量评价中，与DDA测定的522个蛋白相比，DIA测定的1160个可定量蛋白的覆盖率显著更高（图3c）。以前的无标记定量方法通常存在10-50%的LC-MS运行缺失值，这是跨样本可重复定量的瓶颈。我们对组间变量进行比较并发现与DDA（28%）相比，在一个重复组中DIA定量的蛋白质数量 (16%)与DDA结果(28%)相比缺失值更少（图3d）。同时，蛋白质组组成的宽动态范围是深度分析的另一个瓶颈，特别是对于低丰度蛋白质。因此，我们根据蛋白质丰度等级评估了动态范围。通过DDA，我们发现1014种已鉴定蛋白质的丰度跨度约为4个数量级，而DIA中已鉴定的2170种蛋白质跨度约为5个数量级，涵盖了与癌症相关的重要和低丰度癌蛋白。值得注意的是，FDA批准的肺癌药物靶点，如EGFR、MAP2K1和MAP2K2，以及参与NSCLC通路的蛋白质，包括EGFR、NRAS、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MAPK3、CDK4和TP53，很容易在DIA中识别出来。而我们的方法在DDA中只检测到TP53和CDK1（图3e）（https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs/lung）。总之，DIA方法在14个细胞水平上比DDA提供了更高的蛋白质组分析覆盖率、更低的缺失值、可重复性定量性能和更宽的动态范围。
3. 通过iProChip和DIA-MS对微量样品进行定量蛋白质组分析
接下来，我们系统地评估了iProChip-DIA在具有10、50和100个捕捉器的腔室中对PC-9细胞进行蛋白质组学分析的性能。正如预期的那样，iProChip为每个腔室提供精确的细胞计数，以确保能进行精确的定量（图4a）。结合libDIA和dirDIA分析，在1%FDR下，我们在106±2个细胞的三次分析中平均鉴定出4722±10个蛋白质（25785个肽）。在细胞数量较少的腔室中，我们分别从55±1、14±1和低至5±1个细胞中平均鉴定出3435±262、2022±114和1638±191个蛋白质（图4a）。三次重复分析中鉴定的蛋白质重叠率为77-93%，说明iProChip-DIA方法具有高重现性。重要的是，为了表征实验的测定重现性，我们在独立芯片中处理了另一批10个细胞样品。结果显示两个批次的蛋白质鉴定结果水平相似，批次内重叠率为78-84%，批次间重叠率为71%，说明各批次之间的重复性较好。图4 iProChip-DIA在少量细胞蛋白质组学分析的灵敏度、重现性和定量方面的性能a，通过iProChip-DIA对不同PC-9细胞数目的蛋白质组进行鉴定。数据用平均值±SD表示（n=3个独立细胞样本）。b，使用10个细胞捕获室和相应的细胞图像进行单个PC-9细胞捕获，并对已鉴定蛋白质和覆盖范围重复进行三次分析。SC：单细胞；比例尺：100μm。c，在不同细胞数和重复分析（R1-R3）中获得的蛋白质丰度重复性的热图。d，不同细胞数常见蛋白质中总蛋白质丰度的分布。中心线表示平均值；框限表示第25和75个百分位数;须线，1.5×四分位数范围。e，肺癌相关蛋白质的代表性例子，图中显示了根据峰面积计算的蛋白质丰度。f，使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库鉴定不同细胞数下NSCLC通路内蛋白质的覆盖率。
由于受到灵敏度的鼓舞，我们使用10细胞捕获室进一步提高了单个PC-9细胞的分析灵敏度。我们从单个PC-9细胞的三次重复分析中平均鉴定出976±37个蛋白质（3069个肽）（图4b）。通过比较鉴定覆盖率，我们发现在三次重复结果中，69%的蛋白质组和55%的肽段是常见的。为了评估单细胞测量的背景，我们使用iProChip为所有样品制备步骤制备空白对照样品（无细胞上清液）并进行分析。与来自类似研究的88种蛋白质的平均值相比，我们平均58种蛋白质的结果表明来自空白样品的蛋白质相对较少。1细胞和5细胞样品之间存在显著重叠，两者与空白样品的重叠程度最小。这些结果表明该方法具有较低的交叉污染和错误鉴定率。为了将iProChip与批量样品处理进行比较，我们直接处理了小瓶中的约100个细胞，每个细胞中平均只有86个蛋白质组。我们通过注射1.5ng（~10个细胞）和15ng（~100个细胞）的小等分试样进行DIA分析，与稀释处理的小瓶（~50μg裂解物）进行了比较。虽然结果显示iProChip和稀释制剂中15ng的蛋白质和肽的鉴定量相当，但当1.5 ng时，我们从iProChip工作流程中获得了2倍以上的鉴定结果。iProChip对少量的细胞的这种更高鉴定性能进一步验证了我们的方法对有限细胞的效率。此外，当将数据（1-106个细胞）与常规蛋白质组学样品（~1μg PC-9，~6000个细胞，>6000个蛋白质）进行比较时，使用iProChip从少量细胞(1 - 106)中鉴定出的蛋白质有90-96%是常见的。用iProChip捕获的大量蛋白质部分显示出与细胞数量相关的增加趋势。来自1µgPC-9细胞的这6000种蛋白质中有75%是从iProChip处理的106个细胞中鉴定出来的，这表明我们在小样本规模下可以进行类似体积的鉴定。对蛋白质丰度的进一步分析表明，在少量细胞中发现的大部分高丰度蛋白质表明在少量细胞样品中检测低丰度蛋白质的确有较大的挑战。为了评估定量蛋白质组学方法的分析重现性，我们采用两两相关分析方法对三份数据集中的蛋白质丰度进行了定量比较。结果显示，通过我们的iProChip-DIA工作流程（图4c）测量的蛋白质丰度具有良好的重现性（Pearson相关性为0.88-0.98）。为了评估定量性能，我们计算了在每个细胞数中量化的总体蛋白质丰度的分布，这显示了不同细胞数之间的对数线性相关性（图4d）。本研究在单个蛋白质水平上进一步评估了定量蛋白质组分析的能力。代表性的例子选自肺癌相关的癌蛋白，我们根据Spectronaut计算它们的丰度。代表性肺癌蛋白EGFR、CDK1和MAP2K1的平均丰度与增加的细胞数量之间呈现良好的线性关系（图4e）。许多量化的蛋白质，例如TP53、ITGB1、PGK1和MAPK1，在蛋白质丰度和细胞数量（1-106个细胞）之间表现出良好的定量依赖性（50-100倍）（图4e）。与上述定量性能一致，iProChip-DIA能够实现高度的稳定性、良好的重现性和低至单细胞水平的蛋白质组学定量能力。这些蛋白质的鉴定使我们能够根据KEGG数据库中绘制出肺癌相关的信号通路。本研究总共富集了329条通路，例如NSCLC通路、代谢通路、癌症中的通路、剪接体、病毒致癌、癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号传导和细胞凋亡。肺癌的主要通路，NSCLC通路，在不同数量的细胞中覆盖了总共29种蛋白质（图4f）。即使在少量细胞（14±1个细胞）下，我们也鉴定出了13种蛋白质，包括药物靶向EGFR、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MAPK3和KIF5B、肿瘤抑制因子TP53和其他关键信号成分（KRAS、CDK4、CDKN2A、EML4、KIF5B、NRAS、BAX和RB1）（图4f）。就灵敏度而言，EGFR、MAPK1、MAP2K1、MAP2K2、CDKN2A、TP53、KIF5B和GRB2蛋白仅在5个细胞中被检测到，而MAP2K1、KRAS和TP53甚至可以在单细胞水平上检测到（图4f)。基于肺癌模型研究，这些结果揭示了所开发的方法具有蛋白质覆盖的能力，并能在有限的细胞数量下研究癌症蛋白质组和广泛的细胞途径。
4. iProChip-DIA 在白血病单细胞蛋白质组学分析中的应用
接下来，我们在人B-CLL细胞株MEC-1上验证了iProChip-DIA平台的普遍适用性。从方法学开发的角度来看，代表异质癌症类型的白血病细胞是开发灵敏蛋白质组学工具的理想模型，因为它们可以通过描述表型功能的系统范围概况来轻松补充各种现有方法。当在芯片上处理MEC-1细胞时，iProChip的细胞捕获功能显示MEC-1细胞明显小于PC-9细胞。我们使用MEC-1谱图数据库结合dirDIA和libDIA，通过iProChip-DIA对MEC-1细胞进行三次重复分析，在FDR为1% 的情况下从117±1、14±1以及单个细胞平均得到3811±362、931±72和455±98个蛋白质，（图5a）。我们发现蛋白质丰度跨越约5个数量级，并从单个细胞中检测出重要的B细胞表面标志物CD20和HLA分子（图5b），而从14和117个细胞中鉴定出其他关键蛋白质，包括CD19、CD22、CD47和CD74（图5b）。UniProt的功能注释表明，我们从单个MEC-1细胞数据集中鉴定出许多与适应性免疫、先天免疫、激酶、磷酸酶和Ig结构域相关的蛋白质，其中蛋白质覆盖的深度与细胞数量呈正相关（图5c）。通过绘制保存在KinMap中的518种人类激酶，我们在激酶系统发育树的所有分支中鉴定出114种蛋白激酶，例如酪氨酸激酶(TK)、TK样激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪蛋白激酶1(CDK1)、和Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（图5d）。虽然MEC-1细胞比PC-9细胞小，但我们通过使用iProChip-DIA方法实现了良好的蛋白质鉴定覆盖率和重叠程度(61-81%)，表明我们的平台对不同细胞类型的通用性和稳定性。图5 iProChip-DIA在MEC-1细胞蛋白质组学分析中的应用a，通过DIA-MS偶联iProChip对不同MEC-1细胞数量的蛋白质组进行鉴定。数据用平均值±SD表示（n=3个独立细胞样本）。b，基于选择的与免疫癌症标志物相关的蛋白质丰度排序和注释的动态范围评估。c，在UniProtKB数据库中富集免疫相关的和其他功能类别。d，从细胞中绘制114种激酶的激酶树。被列出的激酶家族包括TK(酪氨酸激酶)，TKL(酪氨酸激酶类)，CK1(酪蛋白激酶1)，CAMK(钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶)，AGC(包含PKA, PKG, PKC家族)，CMGC(包含CDKs, MAPK, GSK, CLK家族)，和STE(许多参与MAPK激酶级联的丝氨酸/苏氨酸激酶)。
B细胞受体(BCR)信号转导对建立有效的适应性免疫至关重要，并参与B- CLL中恶性B细胞的生存和生长。B细胞的活化是通过BCR表面受体复合物和特异性抗原之间的相互作用来调控的。iProChip-DIA方法可以定位到BCR通路中83%的蛋白质和关键的BCR共受体，包括CD19、CD21、CD22和CD81。与 Rieckmann 等人使用 28 个原代造血细胞群在超过10000个蛋白质的深度进行的人类免疫细胞蛋白质组学研究相比，从 MEC-1 细胞中鉴定的4211 种蛋白质中有93%是相同的，另外还有 309 种蛋白质在本研究中是被唯一鉴定的。包括相当数量的关键B细胞表面受体，如CD19、CD21、CD22、CD81、FcgRIIB和Igβ41。我们进一步将我们的数据与Johnston等人的B细胞白血病细胞进行了比较。尽管MEC-1细胞系也属于人类B细胞白血病，但通常只有51%的蛋白组在两个数据集之间发生重叠。根据人类蛋白质图谱数据库(https://www.proteinatlas.org/)，常见或独特的蛋白质可能是由细胞类型依赖的蛋白表达。尽管如此，B细胞标记物(如CD19、CD20和CD22)在这两组数据中可以被普遍检测到，而在我们的PC-9数据中未检测到。同样，肺癌标志物(如EGFR和TP53)在MEC-1细胞中未被检测到。这进一步支持了蛋白质表达依赖细胞特异性的概念。综上所述，这些结果证明了该方法的通用性，即该方法可以对不同类型的细胞进行深入的蛋白质组学表征，从而为在肿瘤微环境等复杂系统中解剖细胞异质性铺平了道路。
5. 通过单细胞集成蛋白质组学芯片 (SciProChip) 和 DIA MS 提高灵敏度
受iProChip在蛋白质组覆盖和定量方面结果的启发，我们接下来寻求实现专门用于单细胞20重处理的iProChip，我们将其称为单细胞iProChip (SciProChip)（图 6a，b）。该SciProChip包括20个腔室，每个腔室都包含一个单细胞捕捉器，以便于精确地捕获一个细胞进行蛋白质组处理(图6c)。该芯片显示，通过优化细胞捕捉器的位置和更窄的腔体尺寸，单细胞捕获率提高了~40%(图6d)。与iProChip相比，本芯片的总处理量从312 nL减少到78.5 nL，C18填充柱的长度从2.5减少到1 cm，这都有助于减少样品损失。为兼容其它小细胞，我们将LC-MS/MS梯度时间缩短至90 min。图6 用于20重单细胞蛋白质组学分析的单细胞集成蛋白质组学芯片 (SciProChip)a，用于同时处理20个单细胞的SciProChip照片。b，整体SciProChip布局示意图。控制层显示为粉红色，而流层显示为黑色和蓝色。SciProChip包含20个操作单元。c，带有捕获细胞功能的腔室亮场图像。比例尺：120μm。d，SciProChip的细胞使用效率。数据用平均值±SD表示（n=28）。e，2个独立实验中10个单细胞的蛋白质组鉴定情况。SC：单细胞。f，在重复分析中鉴定的蛋白质的重叠。g，单个细胞总蛋白质丰度的分布。每个数据都作为单独的测量值进行分析。中心线表示平均值；框限表示第25和第75个百分位数；须线，1.5倍四分位距。h，配对Pearson相关性显示了不同单细胞中蛋白质丰度的重复性。i，细胞大小与20个单细胞的蛋白质鉴定数量之间的相关性。
通过使用SciProChip，我们接下来使用两个芯片对从两批细胞培养物中获得的一系列单细胞进行蛋白质组分析。每个批次包含10个单细胞，我们在20个单细胞中可重复鉴定出约1500±131个蛋白质。与iProChip的单细胞分析相比，SciProChip获得了显著提高(1.53倍)的蛋白质组覆盖率(图6e)。我们分别从含由10个单细胞的批次中鉴定出1792和1995个蛋白质。所鉴定的蛋白质在单细胞运行之间实现了良好的重叠(81%-86%)，表明SciProChip-DIA工作流程的高重现性(图6f)。接下来，我们通过计算每个单细胞中的总蛋白质丰度来评估单细胞重复的定量性能，结果显示所有数据集上都有一致的蛋白质丰度对数分布(图6g)。我们通过计算重复样本间蛋白质丰度的配对相关性来评估重现性，并显示出良好的Pearson相关性(图6h)。我们进一步探索了单细胞水平上细胞大小和已鉴定蛋白质组之间的潜在相关性。结果显示鉴定的蛋白质数量似乎与单个细胞的大小无关(图6i)。总之与iProChip相比，SciProChip展示了更高的细胞使用效率和显著提高的蛋白质组覆盖率，同时保持了单细胞蛋白质组轮廓的良好再现性。

讨论

我们报告了能够进行细胞分离、计数、成像和蛋白质组处理的一体化全自动设备，用于微蛋白质组学鉴定以及下至单细胞水平的定量。尽管人们付出了巨大的努力，但数百到大约12000个蛋白质组的覆盖范围仍然有限，我们无法分析含量很低的疾病特异性蛋白质或途径。因此，我们从单个细胞(SciProChip)到10-100个细胞(IProChip)，设计了两个不同容量的芯片，以便进行细胞注入并获得足够蛋白质组深度的实验。基于大小的分选系统可以根据成像信息快速分离细胞，从而消除了使用外部细胞分选器(如荧光激活的细胞分选)的必要性。这种简化的策略减少了多步样品转移过程中的样品损失，最大限度地减少了传统工作流程中的表面吸收，从而提高了蛋白质组学的灵敏度，并具有良好的重复性。为本工作流程定制的试剂可以同时完成多通道的细胞裂解和蛋白质水解，然后脱盐以产生可供MS分析的多肽。重要的是，集成的SciProChip-DIA工作流程实现了单个PC-9细胞1500 ± 131个蛋白质的蛋白质组覆盖。与最近的单细胞蛋白质组学分析研究（包括使用“DISCO”鉴定427个蛋白质，使用MBR的nanoPOTS鉴定1475个蛋白质以及使用基于TMT的SCoPE和SCeptre鉴定1000个蛋白质)相比，本研究报道了一种最灵敏的蛋白质组覆盖策略，并可用于分析单个哺乳动物细胞。我们对良好的分析优点，包括定量线性、蛋白质丰度动态范围宽、重复性好、批间缺失值低等进行了系统的基准测试。我们在小规模样本中鉴定和定量了与NSCLC或BCR信号通路相关的重要药物靶点和生物标志物，显示了chip-DIA工作流程在细胞生物学和临床蛋白质组学研究中的良好适用性。除本研究外，iProChip/SciProChip还有几个方面需要进一步改进。例如，当前芯片的细胞分离可以通过表面标记功能化与细胞分选相结合，以实现对输入细胞亚群的蛋白质组学分析。同时，当前的工作流程是从芯片中收集肽，然后手动将它们转移到传统的自动进样器中，以装载约90%的脱盐肽用于液相色谱-质谱/质谱分析，这导致了相当大的样品损失。我们相信这种肽转移效率可以通过芯片的在线接口直接与LC-MS/MS上的自动进样器进行耦合，这将减少样品损失并显着提高整体灵敏度。高通量能力对于异质样品的单细胞表征很重要。在所展示的平台中，20个单细胞的多重性有待进一步提高。通过合并更多的单细胞处理单元或多路复用分析（例如TMT标记），我们可以进一步增加这种通量。其他提高蛋白质组覆盖率的策略可能受益于使用超低流量纳米液相色谱来提高色谱分辨率，以及使用FAIMS来有效过滤单电荷离子。iProChip/SciProChip是一款多功能、可扩展且强大的设备，其中现有的蛋白质组学方法可以很容易地集成在一起以适应不同的应用。可以想象，除了静态蛋白质组分析之外，我们的芯片还可以作为研究细胞刺激后动态蛋白质组变化的平台，例如，通过配体触发，我们可以直接在芯片上使用细胞成像。该设备可以很容易地集成其他步骤，例如多重等重标记和亚蛋白质组表征，以实现灵敏和多重的蛋白质组学分析。我们可以在装置中进一步掺入多肽富集单元以将单细胞蛋白质组学扩展到蛋白质组的翻译后修饰领域。chip-DIA法有望应用在各个领域，其中包括稀少珍贵样本的分析，例如来自临床标本的稀有细胞群。该方法可以开辟一条新途径，即在不同的功能引入一个单一的小型化平台，从而在单细胞水平上完成蛋白质组学研究。原文链接：  

https://doi.org/10.1038/s41467-021-27778-4

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