科研(IF:24.884)|Nat. Neurosci：揭示在RNA水平上未观察到的阿尔茨海默病大脑蛋白质组学疾病相关的强烈变化

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编译：微科盟-三金，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

人们对阿尔茨海默病(AD)大脑中被破坏的生物过程仍然不完全清楚。因此，在这项研究中我们分析了1000多个脑组织的蛋白质组，以揭示新的AD相关蛋白质共表达模块，这些模块在队列和大脑区域中得到了高度保留。近一半的蛋白质共表达模块，包括AD中显著改变的模块，在来自相同队列和大脑区域的RNA网络中未观察到，这突出了AD的蛋白质病变性质。蛋白质组学网络独有的两个与AD相关的模块，包括一个与MAPK信号传导和代谢相关的模块和一个与母体相关的模块。母体模块受APOE ε4等位基因的影响，但与神经病理学调整后的认知能力衰退率无关。相比之下，MAPK/代谢模块与认知能力衰退率密切相关。蛋白质组独有的疾病相关模块是AD有希望的治疗靶点和生物标志物的来源。

论文ID

原名：Large-scaledeep multi-layer analysis of Alzheimer's disease brain reveals strong proteomicdisease-related changes not observed at the RNA level译名：对阿尔茨海默病大脑的大规模深层多层分析揭示了在RNA水平上未观察到的蛋白质组学疾病相关强烈变化期刊：Nature NeuroscienceIF：24.884发表时间：2022.04通讯作者：Erik C. B. Johnson、Allan I. Levey、Nicholas T. Seyfried通讯作者单位：美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院Goizueta阿尔茨海默病研究中心、医学院神经内科和医学院生物化学系

实验设计

实验结果

如果没有有效的疾病改善疗法，AD仍然是一个相当大的个人和公共健康负担。阿尔茨海默病加速药物伙伴关系( AMP-AD)联合会作为国家努力开发AD治疗药物和生物标志物的一部分，一直在利用基因组、转录组学、蛋白质组学和代谢组学水平上的无偏分子分析数据，进一步了解AD发病机制。遗传学大大促进了人们对AD遗传风险的理解，但遗传风险因素如何影响AD病理生理学的生物学途径并不总是很清楚。要了解人类大脑中AD危险因子多态性的生物学效应，通常需要使用其他组学方法进行额外水平的分析。为此，转录组学已被广泛用于测量AD大脑中的mRNA转录本，并且由此产生的转录组学数据已与AD遗传风险相结合。然而，AD遗传和环境风险的最终生物效应通常是蛋白质及其调节的代谢途径。与基因组学和转录组学相比，由于分析氨基酸聚合物相对于核酸聚合物的复杂性和技术要求增加，迄今为止，蛋白质组学方法对目标分析物的覆盖面相对较少。在这项研究中，我们使用了串联质谱（TMT-MS）方法和AMP-AD死后脑组织联盟，以产生深度TMT AD蛋白网络，大大扩展了我们以前的无标记定量质谱（LFQ-MS）网络，并揭示了新的AD相关蛋白共表达模块。我们利用同样使用其他组学方法(包括基因组学和转录组学)描述的队列的脑组织，对TMT AD蛋白网络进行多层次的基因组、转录组学和蛋白质组学分析，以更好地理解AD背景下这些不同数据类型之间的关系。
1.TMT共识AD蛋白共表达网络
在这项研究中，我们采用基于TMT-MS的定量蛋白质组学方法，对来自对照、无症状AD(AsymAD)和来自宗教秩序研究与记忆衰老项目（ROSMAP，n=84对照，148 AsymAD和108 AD）和旗帜阳光健康研究所的AD脑（Banner，n=26对照，58AsymAD和92 AD）共516个背外侧前额叶皮层(DLPFC)组织进行分析（图1a）。根据统一的分类方案，使用Aβ和tau神经原纤维缠结沉积的半定量组织病理学测量以及死亡时的认知功能来定义病例，如前所述。AsymAD病例是那些具有与AD病例相似的Aβ斑块和tau缠结的神经病理学负担，但在死亡时没有显著的认知障碍的患者，这被认为是AD的早期临床前阶段。经过数据处理和异常值去除后，共使用8619个蛋白质使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）算法构建蛋白质共表达网络（图1b）。该网络由44个模块或蛋白质群落组成，这些模块或群体通过它们在对照和疾病组织中的共表达而相互关联。与我们之前使用LFQ蛋白质组学数据构建的AD共识网络相比，TMT共识网络包含的蛋白质数量是可以分配给模块的蛋白质数量的五倍以上（6337对1205），以及可以分配给模块的定量蛋白质更大比例（73%对36%），突出了与LFQ共识数据相比，TMT数据的深度和连贯性得到了改善。在LFQ共识网络中先前确定的13个模块中，除了最小的模块（由20个蛋白质组成的模块13）之外，每个模块都保存在TMT网络中，也突出了LFQ和TMT蛋白质组学数据的一致性。由于不同的网络聚类算法可以产生不同的网络，因此我们测试了WGCNA算法生成的TMT共识网络的稳健性，同时使用独立算法（MONET M1算法）生成共表达网络。MONET M1被确定为疾病模块识别DREAM挑战中的佼佼者之一，并且基于模块化优化算法，而不是WGCNA中使用的分层聚类方法。我们发现，所有44个WGCNA模块在MONET M1网络中都得到了高度保留，证明了TMT共识网络对聚类算法的稳健性。每个TMT共识网络模块所代表的生物学是使用其组成蛋白的基因本体（GO）分析确定的（图1b）。大多数模块可以被分配一个主要的本体，而那些在本体中模棱两可的模块则被保留为未注释或被指定为“模棱两可”。模块42被赋予术语"母体"，它指的是细胞外基质（ECM）相关蛋白的收集，因为其在ECM和糖胺聚糖结合蛋白中具有强富集性。为了评估模块是否与AD的特征相关，我们将每个模块的特征蛋白或模块蛋白表达的第一主成分（PC）与ROSMAP和Banner队列中存在的神经病理学或认知性状相关联（图1b)。我们还通过确定每个模块是否富集在细胞类型特异性蛋白质标记物中来评估每个模块的细胞类型性质（图1b）。由于该网络具有高功率，并且能够在P=0.05处观察到大多数病理和认知特征的显著相关性为0.1，因此我们能够观察到44个模块中的很大一部分与至少一个病理或认知特征显著相关。十二个模块或模块家族与其他模块或模块家族相比，与AD特征的相关性更强。这些包括突触后密度、糖基化/内质网（ER）、少突胶质细胞/髓鞘形成、RNA剪接、母体、细胞-ECM相互作用、突触/神经元、泛素化、线原激活蛋白激酶（MAPK）信号传导和代谢，线粒体，糖代谢和蛋白质运输模块（图1b）。其中四个模块—M5突触后密度（全局病理学r=–0.32，P=2.7×10⁻⁹；全局认知函数r=0.35，P=7.4×10⁻¹¹），M7 MAPK信号传导和代谢（全局病理学r=0.37，P=4.9×10⁻¹²；全局认知函数r=–0.42，P=1.2×10⁻¹⁵），M11细胞-ECM相互作用（整体病理学r=0.34，P=4.1×10⁻¹⁰；全局认知函数 r=–0.33，P=1.1×10⁻⁹）和M42母体（总病理学r=0.75，P=1.1×10⁻⁶⁰；全局认知函数r=–0.4，P=2.3×10⁻¹⁴）—在12个模块中，与AD神经病理学或认知最密切相关。TMT管道提供的额外分析深度还使我们能够识别大量与LFQ网络几乎没有重叠的新模块。其中包括M17转录、M21主要组织相容性复合物/免疫、M6核糖体、M19轴突发生和M9高尔基体模块，其中大约80%或更多的模块蛋白在LFQ网络中未被定量，包括与模块特征蛋白（即“枢纽”蛋白）具有强相关性的大多数蛋白质。其中三个新模块-M24泛素化，M29糖基化/ER和M42母体模块-与AD内表型密切相关。为了评估给定的TMT网络模块在AD的早期阶段是否被改变，我们比较了对照组、AsymAD和AD病例中的模块特征蛋白（图1c）。与对照组相比，12个AD相关性最高的模块中有4个在AsymAD中显著增加或显著减少，而其他8个仅在AD中发生很大变化。在AsymAD中增加的模块包括M42母体和M11细胞-ECM相互作用，而在AsymAD中减少的模块包括M5突触后密度和M8蛋白转运。与tau微管结合域（MTBR）肽水平升高最强的模块是M42母体和M11细胞-ECM模块，而与MTBR负方向相关性最强的模块是M5突触后密度以及M1和M4突触/神经元模块。与MTBR相关的模块在AsymAD中也倾向于被改变。总之，对500多个脑组织的TMT-MS分析使我们能够量化8600多种蛋白质，并构建一个强大的蛋白质共表达网络，该网络具有很高的检测AD相关模块的能力，包括之前LFQ共识网络中不存在的大量新模块。这些新模块中的一些也在AD的早期阶段被改变，可能反映了在AD神经病理学存在下但在认知能力下降之前发展的病理生理过程，并且与tau稳态失调相关。图1 TMTAD蛋白共表达网络a–c，通过TMT-MS蛋白质组学（a）分析了来自ROSMAP（n=84对照，148 AsymAD和108 AD）和BannerSun Health脑库（Banner，n=26对照，58 AsymAD和92 AD）的516个DLPFC组织。经过异常值去除和数据处理，共对488例病例中的8619种蛋白质进行了量化，并通过差异表达和共表达方法进行了分析。b，利用WGCNA构建了一个蛋白质共表达网络，由44个蛋白质共表达模块组成。模块相关性显示在中央树状图中。采用GO分析对各模块所代表的主要生物学进行鉴定，没有明确的模块则未被术语所描述。模块特征蛋白与ROSMAP和Banner队列中存在的神经病理学和认知特征相关（红色，正相关；蓝色，负相关）。整体病理学、Lewy体阶段、TDP-43阶段和整体认知水平特征仅存在于ROSMAP中。与神经病理学和/或认知特征高度相关的44个模块中有12个以粗体显示，与特征相关性最强的4个模块以红色突出显示。通过模块蛋白与神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞的细胞类型特异性标记列表重叠来评估每个模块的细胞类型性质。c，b中以粗体显示的12个最强性状相关模块的模块特征蛋白水平（按案例状态）。模块按在AsymAD中更改的模块（n=4，左）和仅在AD中更改的模块（n=8，右）分组。n=106对照，200 AsymAD和182 AD。按病例状态的差异通过Tukey检验的单因子方差分析评估模块特征蛋白。*P<0.05，***P<0.001。方框图表示中位数以及第25和第75百分位数，方框误差线表示组中两个中间四分位数的四分位数间范围。数据点高达方框误差线四分位数范围的1.5倍，可定义误差线的范围。Cntl，控制；MHC，主要组织相容性复合物。 2.模块在队列和大脑区域之间保留
TMT AD蛋白网络由DLPFC Brodmann区域9（BA9）组织产生，来自一个机构分析的两个中心。为了确定网络模块是否也存在于其他大脑区域中并且对中心和分析方式具有稳健性，我们分析了来自ROSMAP队列中113名参与者的额叶皮层BA6（n=113）和颞叶皮层BA37（n=113）的226对组织、来自MountSinai脑库的151个海马旁回（PHG）BA36组织以及来自DLPFC BA9的40个组织和来自Emory脑库的BA24，其中还包括帕金森病（PD）病例（图2a）。使用类似的质谱方式在不同的中心分析Mount Sinai脑库。使用TMT方法分析所有组织，以及同步前体选择（SPS）-MS3 TMT定量方法分析Emory脑库。我们为每个队列生成了蛋白质共表达网络，然后评估了TMT AD网络模块是否在每个队列和大脑区域中保留。我们发现几乎所有TMT AD网络模块在队列和大脑区域都得到了保留（图2b）。我们通过测量TMT共识AD网络“合成”特征蛋白或每个独立网络中每个共识模块中前20%的蛋白质，评估了TMT AD网络模块在每个队列和大脑区域中的病例状态如何不同（图2c)。由于ROSMAP BA6和BA37组织是在受试者内采样的，因此我们能够在同一个体的这两个区域之间直接比较模块合成特征蛋白。所有TMT AD网络模块的改变方向与在DLPFC中观察到的跨脑区和队列的改变方向相似。有趣的是，在同一个体中评估时，颞叶皮层中的M7 MAPK/代谢和M42母系模块比颞叶皮层增加得更强烈，这可能是由于在AD中该大脑区域更早和更严重地受累。尽管M7 MAPK/代谢模块似乎有增加的趋势，M5突触后密度模块在前扣带回中降低，AD患者额叶皮质或前扣带回的大部分AD相关模块没有明显改变，这与PD中该大脑区域与DLPFC相比受到更严重影响的趋势一致。总之，我们观察到几乎所有的TMT AD网络模块在不同的队列、中心、MS方法和大脑区域中都被保留下来，这表明观察到的蛋白质共表达关系对技术假象是稳健的，并且不是DLPFC所独有的。图2 跨不同群组、中心、方法和大脑区域的TMT AD网络的保存a–c，在ROSMAPBA6（额叶皮层）和BA37（颞叶皮层），Emory BA9（DLPFC）和BA24（前扣带回）以及MountSinai脑库BA36 PHG组织（a）中对DLPFC BA9组织生成的TMT AD网络进行模块保存和合成特征蛋白分析。Emory组织包括PD病例，并使用不同的TMT定量方法（SPS-MS3）进行分析。Mount Sinai脑库由基于MS2的TMT-MS在另一个中心进行处理和分析。b，图1b，c中突出显示的12个性状相关模块的模块保存。具有Z_summary的模块分数≥1.96（或q=0.05，蓝色虚线）被视为保留，而具有Z_summary的模块分数≥10（或 q=1×10⁻²³，红色虚线）被认为是保存完好的。所有TMT AD网络模块的保存统计信息在扩展数据图3中提供。c，通过测量TMT AD网络合成特征蛋白，按病例状态评估模块特征蛋白水平，并测量每个队列和区域中按模块kME表示的前20%的模块蛋白。显示了四个与性状相关性最强的TMT AD网络模块的合成特征蛋白水平。ROSMAP BA6 n=25对照，53 AsymAD，35 AD；ROSMAPBA37 n=25对照，53 AsymAD，35 AD；Emory BA9 n=10控制，20 AD，10 PD；Emory BA24 n=10控制，20 AD，10 PD；MountSinai BA36 n=45对照，13 AsymAD，93AD，合成特征蛋白水平的差异通过单因子方差分析进行评估。方框图图表示中位数以及第25和第75百分位数，方框图误差线表示组中两个中间四分位数的四分位数间范围。数据点高达方框图误差线四分位数范围的1.5倍，可定义晶须（误差线）的范围。ant，前部；CTL，控制；Ctx，皮层，temp，温度。 3.在转录组学网络中未观察到的模块
迄今为止，大多数AD共表达网络分析都是使用定量RNA测序（RNA-seq）数据进行的。然而，并非所有mRNA转录本都与蛋白质水平密切相关。为了比较RNA和蛋白质AD共表达网络之间的异同，我们在532个ROSMAP DLPFC组织中测量的15582个转录本上生成了AD RNA网络，其中168个与用于生成TMT AD蛋白质网络的组织重叠（图3a）。我们注意确保用于网络构建的病例分类和WGCNA管道在蛋白质和RNA数据集之间保持一致。鉴于与测量的蛋白质相比，测量的转录本数量更多（n=15582vs 8619），所得到的RNA网络包含的模块比蛋白质网络多（n=88vs 44）。我们使用网络保存统计数据来确定蛋白质网络中的哪些模块保存在RNA网络中。我们发现略多于一半的蛋白质模块保存在RNA网络中（44个模块中有26个Z_summary>1.96或P≤0.05）。在RNA网络中保存的模块包括AD相关模块M1突触/神经元，M2线粒体，M3寡核苷酸/髓鞘形成，M5和M22突触后密度，M8蛋白转运，M11细胞-ECM相互作用，M20 RNA剪接和M25糖代谢。然而，还有18个蛋白质网络模块未保存在RNA网络中，包括AD相关模块M7 MAPK/代谢、M24泛素化、M29糖基化/ER和M42基质体（图3b）。在这些模块中，M7 MAPK/代谢模块（与TMT AD网络中认知功能相关性最高的模块）保存最少，Z_summary得分接近0，表明即使在同一个体的同一大脑区域取样的组织中，蛋白质和RNA共表达之间也存在显著差异。共表达分析表明，蛋白质和RNA网络之间的保存程度高于基于蛋白质和RNA之间差异表达比较的预期水平，即使在成对组织中也是如此。当来自M42母体模块的蛋白质（TMT AD网络中差异表达最高的蛋白质）被排除在分析之外时，这种相关性仍然适中。总体而言，我们发现蛋白质网络模块与认知功能的相关性比RNA网络模块更强，但在大多数情况下，它们与病理学的相关性与RNA模块相似（在正和负方向上平均约为0.15）。一个引人注目的例外是M42母体模块，它是与任何AD性状相关性最强的模块，与整体病理学的相关性为0.75，并且不存在于RNA网络中。RNA网络中M42的合成特征转录显示与疾病的关系最小，并且一些特征转录物（例如M7 MAPK/代谢）与蛋白质相比显示出与AD相反的关系，这可能表明这些模块蛋白在RNA水平上存在补偿性调节机制。蛋白质网络也显示了比RNA网络在模块和性状相关性上更大的总体差异。总之，我们观察到大约一半的TMT AD蛋白网络模块不存在于来自相同脑区的RNA网络中，包括与AD病理学和认知功能最密切相关的两个蛋白质网络模块，突出了蛋白质组对理解AD病理生理学的独特贡献。图3 TMTAD蛋白网络包含转录组中不存在的与AD相关的模块a-d，来自ROSMAP队列（BA9；对照=125，AsymAD=204，AD=203;168个蛋白质组学分析的重叠病例）和Mount Sinai脑库（BA10;对照=54，AsymAD=19，AD=120）的Asym AD和AD额叶皮层组织由WGCNA算法以类似于TMT AD蛋白网络（a）的方式进行分析。b，将TMT AD蛋白网络的模块保存到ROSMAP RNA网络中。具有保留Z_summary的模块得分低于1.96（q>0.05）不被认为被保留。具有Z_summary的模块分数大于或等于1.96（或q=0.05，蓝色虚线）被视为保留，而具有Z_summary的模块分数大于或等于10（或q=1×10⁻²³，红色虚线）被认为是保存完好的。右侧列出了未保存在RNA网络中的TMT AD网络模块，以及它们与ROSMAP中整体病理学和整体认知性状的相关性。c，TMT AD网络模块蛋白与Drummond等人描述的与NFT（n=543）和Aβ斑块（n=270）共定位的蛋白质重叠。与深黄色色调或较暗色调所示的重叠被认为是显著的。d，M7 MAPK/代谢（左，n=234 个总蛋白）和M42母系体（右，n=32个总蛋白）模块按模块kME排列的前50个蛋白质，突出显示了与NFTs（绿色），Aβ斑块（橙色）或两者（蓝色）共定位的模块蛋白。蛋白质之间的线表示相关基质邻接权重。所有TMTAD网络模块的图表均在补充数据中提供。Cog，认知；Path，病理学。 4.富含与斑块和缠结共定位的蛋白质的模块
为了更好地了解TMT AD蛋白网络模块与标志性的AD神经病理学淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块和神经原纤维缠结（NFTs）之间的潜在空间关系，我们对之前基于激光捕获显微切割（LCM）和LFQ蛋白质组学分析，同时对先前被确定为与Aβ斑块和NFT共定位的蛋白质进行了模块重叠测试（图3c)。我们发现M1和M4突触/神经元，M2线粒体和M14蛋白折叠模块高度富含在斑块和缠结中发现的蛋白质。M7 MAPK/代谢模块也富含斑块和缠结，但Aβ斑块相关蛋白含量更高，M25糖代谢模块也是如此。NFT在来自M28和M44核糖体/翻译、M29糖基化/ER和M13 RNA剪接模块的蛋白质中独特富集。令人惊讶的是，尽管淀粉样蛋白前体蛋白（APP）（主要由Aβ驱动的蛋白质组学测量）和载脂蛋白E（ApoE）是该模块的成员，但通过LCM鉴定的核心斑块蛋白并没有显著增加。与对照组相比，M42在AsymAD和AD中升高，这与神经炎性斑块相关。当分析扩展到至少一个LCM实验中鉴定的一组不太严格的斑块相关蛋白，而不是在多个实验中鉴定的蛋白时，发现M42显著富含斑块相关蛋白。这表明我们的TMT蛋白质组学和共表达分析可能捕获了大量通过LFQ-MS方法不太可靠地观察到的斑块相关蛋白，即使使用LCM分离，例如SPARC相关的模块化钙结合蛋白1（SMOC1），肝素结合细胞因子（MDK）和神经生长因子（NTN1）。例如，尽管LCM未将其鉴定为核心Aβ斑块相关蛋白，但MDK在免疫组织化学上表现出与其与Aβ斑块共定位一致的染色模式。M7 MAPK/代谢和M42母体模块中的其他蛋白质已被证明通过免疫组织化学与Aβ斑块和NFT共定位。M42母体模块中的许多蛋白质共享硫酸肝素和糖胺聚糖结合结构域，可能介导它们与Aβ原纤维的相互作用。根据模块特征蛋白相关值（kME）显示，图3d显示了与前50个M7 MAPK/代谢和M42母系体模块蛋白重叠的NFT和核心Aβ斑块蛋白。总之，我们发现几种TMT AD蛋白网络模块富集在NFTs和Aβ斑块中发现的蛋白质，包括M7 MAPK/代谢模块，与这些生物学过程与标志性AD病理学之间的空间关系一致。 5.母体模块蛋白水平受 APOE ε4影响
我们使用基于基因的关联测试评估了有哪些TMT AD网络模块富集在与AD相关的遗传位点中，这些基因位点由全基因组关联研究（GWAS）确定（图4a)。我们发现M42母体、M30蛋白酶体和M29糖基化/ER模块显著富集AD风险基因，而M7 MAPK/代谢模块表现出富集趋势。M42中的强富集是由模块内的ApoE蛋白驱动的，因为它对AD风险的影响很大。虽然基于基因的关联测试提供了关于网络模块是否可能参与上游疾病过程的信息，但它们没有提供关于基因组变异如何影响模块水平的信息。为了解决这个问题，我们使用来自ROSMAP和Banner队列的全基因组基因分型进行了模块定量性状位点（mod-QTL）分析。在全基因组的显著性水平上，在调整诊断和性别以及其他变量后，我们发现rs429358是M42母体模块的近端mod-QTL（在1Mb内，即顺式）（表1）。rs429358位于APOE位点，定义了APOE ε4等位基因。当我们通过rs429358单核苷酸多态性（SNP）的剂量绘制M42特征蛋白时，这种mod-QTL进一步明显（图4b）。此外，M42是唯一观察到随APOE基因型变化的模块（图4c）。值得注意的是，rs429358在线性回归模型中测试诊断时不影响ApoE蛋白水平（P=0.44）。当我们按基因型和病例状态分析ApoE蛋白水平时，证实了这一点（图4d），表明rs429358引起的M42水平变化与ApoE水平无关。总之，我们发现三个TMT AD网络模块对AD遗传危险因素有显著富集，其中一个模块的水平——M42母体——受独立于诊断或ApoE蛋白水平的APOE遗传变异的影响，特别是在疾病的无症状阶段。图4 M42母体模块富含AD遗传风险，并由APOEε4增加a，b，GWAS在TMT AD网络模块中鉴定的AD遗传危险因子蛋白的富集（a）。红色虚线表示Z值为1.96（P=0.05），高于该分数的富集率被认为显著。M42中的浓缩是由ApoE驱动的。模块按相关性排序，如图1b所示。b，模块特征蛋白水平按等位基因剂量（0，1，2）对于确定为近端mod-QTL的三个SNPs，按病例状态分隔。M42 rs429358 AsymAD（0，1）P=6.9×10^–07；M8 rs6940448 AsymAD（0，1）P=0.003，AsymAD（0，2）P=5.5×10^–6；M8 rs10458081 AsymAD（0，1）P=0.0007，AsymAD（0，2）P=6.7×10^–5。M42 rs429358 n=93控制（0），10控制（1），138 AsymAD（0），43 AsymAD（1），95 AD（0）， 51 AD（1），5 AD（2）。M8 rs6940448 n=52控制（0），40控制（1），11控制（2），80 AsymAD（0），81 AsymAD（1），20AsymAD（2），60 AD（0），70 AD（1），21 AD（2）。M8rs10458081 n=52控制（0），40控制（1），11控制（2），77 AsymAD（0），85AsymAD（1），19 AsymAD（2），61 AD（0），70 AD（1），20 AD（2）。c，M42母体模块的特征蛋白水平按APOE基因型，按病例状态分开。AsymAD 2/2或2/3至3/4或4/4 P=0.0002；AsymAD 3/3至3/4或4/4P=0.005；AD 2/3至3/4或4/4 P=0.01。控制n=20（2/2或2/3），75（3/3），10（3/4或4/4）；AsymAD n=26（2/2 or 2/3），122（3/3），45（3/4 or 4/4）；AD n=15（2/3），97（3/3），66（3/4或4/4）。d，ApoE水平按APOE基因型划分，按病例状态划分。ApoE在AsymAD和AD中增加，但APOE基因型不影响ApoE水平。控制n=20（2/2或2/3），75（3/3），10（3/4或4/4）；AsymAD n=26（2/2or 2/3），122（3/3），45（3/4 or 4/4）；ADn=15（2/3），97（3/3），66（3/4或4/4）。特征蛋白水平的差异通过Tukey检验的单因子方差分析进行评估。仅显示案例状态组中的显著差异。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。方框图图表示中位数以及第25和第75百分位数，方框图误差线表示组中两个中间四分位数的四分位数间范围。数据点高达方框图误差线四分位数范围的1.5倍，可定义晶须（误差线）的范围。MHC，主要组织相容性复合物。 表1 TMT AD网络模态QTL 
6.MAPK/代谢模块与认知轨迹相关
我们发现10个模块与认知能力下降显著相关，11个模块与认知保存显著相关，无需神经病理学的调整（表2）。与认知能力下降最密切相关的模块包括M7 MAPK/代谢，M15模糊块和M42母系体，而与认知保存密切相关的模块包括M33模糊块，M5突触后密度和M2线粒体。经神经病理学调整后，M42母系体、M11细胞-ECM相互作用、M20 RNA剪接和M25糖代谢模块不再与认知能力下降显著相关，M44核糖体/翻译、M32模糊块和M9高尔基体模块不再与认知保存相关。M7 MAPK/代谢及其相关模块M15（模糊块）与调整后的认知能力下降率以及另外五个模块（包括M24泛素化模块）保持显著相关（图5a）。与认知能力下降率显著相关的七个模块中有五个是蛋白质网络所独有的。在神经病理学调整后，仍与认知保存显著相关的模块包括M2线粒体和相关模块M33（模糊块），M5突触后密度和M29糖基化/ER模块，这是蛋白质网络独有的（图5b）。为了进一步研究TMT AD网络模块与认知轨迹的关联，我们评估了哪些模块在神经病理学调整后富含与认知弹性呈正相关或负相关的蛋白质，正如最近在ROSMAP中进行的蛋白质组范围关联研究（PWAS）所确定的那样（图5c）。与我们的模块关联分析一致，我们发现M7 MAPK/代谢和M15模糊块在与认知弹性负相关的蛋白质中显著富集，而M5突触后密度和M8蛋白质运输模块在与认知弹性正相关的蛋白质中显著富集。
表2 TMT AD网络模块与认知轨迹的关联
图5 M7MAPK/代谢模块与认知能力下降有关
a–c，与ROSMAP中十种神经病理学调整后，TMT AD网络模块与认知能力下降（a）或认知保留（b）相关。在ROSMAP中，每个参与者的特征蛋白值（n=328）在生活中的认知变化率相对应。下降以红色突出显示；保留以蓝色突出显示。β是在神经病理学调整后模块特征蛋白对认知轨迹的影响大小；q是此效应的FDR显著性水平。阴影区域表示β值的95%置信区间。c，TMT AD网络模块富集与认知弹性呈正相关（即保存）或与认知弹性负相关的蛋白质（即衰退），在先前的PWAS中确定的ROSMAP队列中的认知弹性。红色虚线表示Z值为 1.96（P=0.05），高于该值的富集率被认为显著。带阴影的模块与a和b中的结果一致。模块按相关性排序，如图1b 所示。MHC，主要组织相容性复合物。

讨论

在这项研究中，我们通过TMT-MS分析了多个中心、队列和大脑区域的1000多个脑组织，以开发一个强大的TMT AD蛋白网络，该网络显著扩展了我们之前的共识LFQ AD网络。使用多层组学方法，我们确定了与AD密切相关的新蛋白质网络模块，这些模块在基于RNA的网络中不存在。其中一些模块，如M7 MAPK/代谢模块，即使在调整神经病理学后，也与ROSMAP中的AD神经病理学和认知轨迹相关，其中一个模块——M42母系体模块——受到APOE位点的影响。这些发现强调了扩展蛋白质组学分析深度以揭示其他AD相关蛋白质共表达网络变化的效用，以及分析越来越多的具有综合临床和病理表型的队列以提供跨多组数据集识别疾病相关关系所需的统计能力的价值。M7 MAPK/代谢模块与认知功能密切相关，并且还与神经病理学调整后的认知轨迹相关，而M42母系体模块与其与神经病理学相关调整后的认知轨迹无关。M42在AD遗传风险中富集，主要是由于ApoE是该模块的成员，其mod-QTL与APOE位点相关。因此，人们可以假设一个模型，其中M42所体现的病理生理学对于随后的下游AD病理变化是必要的，但是与认知能力下降最密切相关的病理变化，例如由M7 MAPK/代谢模块等代表的病理变化，是AD认知能力下降的主要效应因素和/或调节因素。M42不存在于RNA网络中，含有几种先前已被TMT-MS鉴定的蛋白质，并显示与Aβ相关。这些蛋白质，如MDK，NTN1和SMOC1，即使使用LCM从周围的脑实质中分离斑块进行MS分析，LFQ-MS似乎也不太可靠地检测到，这可能反映了它们与Aβ斑块内其他蛋白质的相对丰度较低，或者它们对可能在组织固定过程中被破坏的斑块的潜在弱结合亲和力。MDK和NTN1先前已被证明可以直接与Aβ结合。有趣的是，许多M42蛋白含有肝素、硫酸肝素和糖胺聚糖结合结构域，这些结构域可能介导它们与Aβ斑块的相互作用。ApoE是M42模块的成员，也被证明与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用，并且这种结合相互作用的丧失被认为是最近在presenilin-1常染色体显性遗传AD突变体中描述的ApoE Christchurch功能丧失突变所提供的显著保护的可能机制。M42中的其他蛋白质可能通过不同的机制影响Aβ斑块病理生理学，例如分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1），其调节Wnt信号转导，并已被证明可以抑制整合素和含金属蛋白酶结构域的蛋白质10（ADAM10），该蛋白质对调节Notch信号传导和Aβ代谢很重要。在多大程度上调节M42蛋白水平、酶活性或蛋白-Aβ/蛋白-蛋白聚糖相互作用可能影响Aβ斑块沉积或其下游后果仍有待确定，但这些蛋白代表了AD有希望的治疗靶点，它们也可能代表有前途的生物流体AD生物标志物。事实上，我们最近已经证明，SMOC1在AD脑脊液中明显升高。在分析模块水平和认知轨迹之间的关联中，我们观察到M7在调整神经病理学后仍然与认知能力下降相关，这表明AD中该模块的变化可能不仅仅是由于对斑块和缠结的反应。事实上，尽管M7趋向于AsymAD的增加，但与对照组相比，这种变化并不显著。这一观察结果及其与认知能力下降的相关性，以及许多M7中枢蛋白（如UBA1）作为对认知弹性的研究，表明增加的M7 MAPK/代谢水平将对认知功能有害，这一事实与PWAS中的认知功能下降独立相关。然而，强大的小胶质细胞代谢功能对于对淀粉样蛋白斑块的有益应激反应非常重要，并且似乎对维持衰老过程中的认知功能也很重要。此外，在这项研究中，M7倾向于AD遗传风险的富集，这表明，也许M7的功能丧失对认知功能有害。在我们之前的LFQ研究中也观察到了这个明显的悖论，其中M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块（M7和M11的母体模块）水平的增加与认知功能降低密切相关，但许多关键的M4蛋白被注意到与小鼠模型中的有益炎症反应有关，并且在快速进展的AD病例中降低。因此，M7所体现的应激反应可能在AD中起到有益和有害的作用，并且确定对增强的潜在有益反应的哪些方面，或对抑制的不利反应，可能需要在适当的动物模型或人体临床试验中进行直接调节实验以及测量这种反应的生物标志物。以M7为代表的生物反应的进一步研究和调节是AD治疗开发的关键目标。我们的研究证明了除了分析蛋白质的编码转录本之外，直接分析蛋白质的重要性。正如可以预期的那样，在存在特征性蛋白质代谢障碍的情况下，由认知能力下降定义的疾病，该观察表明，与AD病理生理学相关的生物学变化的很大一部分是通过mRNA丰度或共表达的变化没有反映出来的机制发生的，并突显了整合多级组学数据对进一步了解疾病和选择潜在的疾病修饰治疗开发靶点的重要性。原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35115731/

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