上海交大系统全面综述|单细胞蛋白质分析的前景（国人佳作）
编译：微科盟-廿九，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读在单细胞分辨率上分析蛋白质的表达对于基础生物学研究(如细胞分化和肿瘤微环境检查)和临床精准医学(研究有限数量的原代细胞)是必不可少的。随着工程、化学和生物学的最新进展，单细胞蛋白质分析方法得到了迅速发展，这使数千个单细胞中的高通量和多路复用的蛋白质测定成为可能。结合单细胞RNA测序和质谱分析技术，单细胞多组学分析可以同时检测单个细胞中的多种形态，包括mRNA、蛋白质和代谢物，并可对细胞信号过程(如DNA修饰、染色质可及性、蛋白质丰度和基因扰动)进行更全面的研究。本文综述了近十年来单细胞蛋白质分析技术的最新进展和应用。文中还讨论了该领域目前的局限性、挑战和未来可能的发展方向。
论文ID
原名：The Intriguing Landscape of Single-Cell Protein Analysis译名：单细胞蛋白质分析的前景期刊：Advanced ScienceIF：16.806
发表时间：2022.02通讯作者：丁显廷
通讯作者单位：上海交通大学生物医学工程学院个性化医学研究所癌基因及相关基因国家重点实验室
主要内容
1. 前言
单细胞分析是唯一能够表征由基因、蛋白质和代谢物随机表达引起的细胞间异质性的方法。这对于干细胞和那些具有高度动态性和亚群异质性的细胞(如早期胚胎发育和神经干细胞分化)的分析尤为重要。在过去的十年里，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术已经成为研究细胞异质性的一种强有力的方法，它可以在全基因组水平上确定基因的调控网络。然而，mRNA转录丰度只与蛋白质丰度部分相关，这解释了稳态蛋白质水平的大约三分之一到三分之二的变异。细胞的蛋白质丰度与一系列显著的过程密切相关，如转录、mRNA降解、翻译和蛋白质降解。蛋白质是在活细胞中执行生命和生物功能的最重要的分子之一。蛋白质及其复合物构成细胞的骨架和结构，在大多数细胞过程中起着关键作用，包括催化生化反应、分子跨膜运输、细胞生长和分裂、细胞粘附和迁移等。表征蛋白质的数量、结合和活性对于理解细胞分化和命运、细胞信号转导途径、疾病进展和临床诊断等细胞过程的分子机制至关重要。为了充分理解生物过程的复杂性，人们有必要在单细胞水平上测量蛋白质的表达。然而，单细胞蛋白质组学分析是一个巨大的挑战，主要是因为单个哺乳动物细胞中的蛋白质含量相当低，并且蛋白质不能像基因一样被扩增。另一方面，大规模的蛋白质鉴定和定量仍然是一个障碍，因为在一个小体积的单个细胞中，不同表达水平的蛋白质种类可以达到10000多种。
近年来，随着工程技术和分子生物学的发展，单细胞蛋白质分析的自动化和小型化流程取得了突飞猛进的进展，特别是在高度多元化的蛋白质测定方面。例如，人们已经在微流控芯片上实现单细胞蛋白质组分析，该芯片可进行细胞的分离、捕获、处理和裂解，以及随后的蛋白质和代谢物的定量。单细胞蛋白质组学方法学的新突破，如单细胞条形码芯片(SCBC)、单细胞蛋白质印迹分析 (ScWB)、质谱流式细胞技术(CyTOF)、质谱单细胞蛋白质组学、转录组和表位的细胞索引技术(CITE-Seq)等，为我们提供了通过大规模蛋白质图谱区分不同细胞亚群和推断原因机制的机会。更重要的是，单细胞分析的趋势已经从“单一组学”转向“多组学”(基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学)，使得以时空分辨率分析染色质可及性、DNA、RNA、蛋白质和代谢物成为可能。数以千计的多组学定量数据必将加深我们对生物系统中转录和翻译之间复杂关系的理解。
本文介绍了近十年来单细胞蛋白分析方法的研究进展。本文综述了现有单细胞蛋白分析方法的原理、技术特点及其在细胞分子生物学和医学研究中的应用。我们还介绍了新兴的单细胞多组学分析技术的原理、特点和应用，这些技术可以同时检测单细胞中的DNA、RNA、蛋白质和代谢物。最后，我们讨论了单细胞蛋白方法的局限性和未来的挑战，如低丰度蛋白检测，多重蛋白检测，以及将大的、复杂的和多模式的数据集成到特定的生物模型中。
2. 当前单细胞蛋白质分析方法的综述
为了更好地决定在特定研究中采用哪条管线进行单细胞蛋白质分析，我们需要考虑一些基本原则(图1)。首先，要分析的蛋白质是已知的还是未知的？这个问题决定了使用靶向蛋白检测策略还是非靶向检测策略；第二，是否需要获取蛋白质在细胞中的位置信息。例如，我们是在检测核蛋白、细胞质蛋白、细胞表面蛋白还是细胞分泌蛋白？这将有利于选择合适的单细胞捕获和培养策略，并确定是否需要对细胞进行固定和裂解。最后，我们还应该了解被分析的蛋白质是疏水的还是亲水的。选择合适的样品前处理系统以避免目标蛋白的丢失是至关重要的。基于基本的方法设计，当前的单细胞蛋白质分析技术可以概括为两大类：一类是以SCBC、质谱和单细胞免疫印迹技术(WB)为代表的靶向蛋白质分析技术，另一类是以MS为代表的非靶向蛋白质技术。值得注意的是，单细胞多组学技术已经成为测量单个细胞基因组、转录、蛋白质组和代谢状态的有力工具。与单细胞基因组学、转录组学和表观基因组学相比，多组学技术为研究人员提供了丰富的多模态信息，以揭示生物学研究中生物学过程的复杂性。因此，我们将在单独的一章中介绍和讨论单细胞多组学技术及其生物学应用。
图1 单细胞蛋白质分析通常涉及三个问题：A)被分析的蛋白质是已知的还是未知的，B)蛋白质在细胞内/膜上还是在细胞外，C)被分析的蛋白质是疏水的还是亲水的。
3. 靶向蛋白质分析方法
传统的免疫检测大多是以抗体为基础的技术，如WB、酶联免疫吸附试验(ELISA)和邻近连接试验(PLA)。它们的共同特征是具有抗体亲和试剂来识别目的蛋白，并具有输出不同信号的功能。然而，传统的免疫分析方法仅限于在单细胞水平上提供目标蛋白的定量检测。提供单细胞分辨率的最直接的解决方案是单细胞微孔阵列，其中人们通常采用的手段是利用微流控芯片进行单细胞分离。
3.1 小型化免疫分析
大多数细胞内蛋白的拷贝数都很低，因此人们急需高灵敏度和高特异性的分析方法。近年来，一些基于微流控器件的小型化免疫分析方法，如微芯片、SCBC、条形码上磁珠抗体微阵列、微流控芯片、和单分子阵列技术，已经被开发出来用于单细胞水平的多重蛋白质检测。
SCBC使用抗体条形码阵列微流控芯片来测量单细胞蛋白质。在SCBC方法中，单个或规定数量的细胞被捕获在纳升体积的微室中，并被抗体阵列包围。在裂解或分泌时，蛋白质将结合到阵列上，并用二级荧光抗体进行检测，其中荧光的位置可以表明目标蛋白质的身份。Yamanaka等人开发了一种基于纳米孔阵列的微刻技术，用于并行量化数千个单细胞的分泌反应，如图2A所示。在微刻技术中，单个细胞被隔离在纳米孔的微芯片阵列中，人们用细胞因子特异性抗体修饰的玻璃片压在阵列上，以捕捉每个孔中细胞分泌的细胞因子。Yang等人描述了一种新的SCBC方法，它能够在单细胞水平上分析非常罕见的肿瘤细胞的多个蛋白质标志物。这种SCBC方法基于一个由15000个60pL大小的微孔和一种新型的珠状条形码抗体微阵列组成的微芯片，如图2B所示。人们在60个pL大小的微孔阵列中分离单个细胞，用于细胞裂解和随后的蛋白质标志物检测。通过为每个蛋白质分配两个独立的磁珠标识符(例如珠粒大小和荧光颜色)来实现多路复用蛋白质检测。此外，SCBC已被应用于了解表皮生长因子信号通路，通过定量分泌蛋白来测量T细胞反应，以及描绘循环中的肿瘤细胞。
图2 基于抗体的单细胞蛋白质组学方法
A)使用细胞条形码提高单个细胞测量通量的示意图。不同的细胞组用独特的荧光染料(条形码)组合标记；人们将这些细胞组合并加载到纳米孔阵列上(上图)。细胞存活率和表面标志物的表达(标记在芯片上)，以及每个细胞的条形码，通过细胞成像仪测定。条形码在图像分析过程中发生去卷积，以用于识别每个细胞的原始组(下图)。B)基于BOB阵列的单细胞多重蛋白质检测示意图：抗体与用颜色编码的磁珠结合，通过免疫分析测量蛋白质；C)单细胞蛋白质印迹分析的原理和工作流程：scWB分析包括细胞沉降、变性RIPA缓冲液的化学裂解、PAGE、紫外光引发的蛋白质固定在凝胶上、扩散驱动的抗体探测和荧光成像。D)在单个细胞中同时定量mRNA和蛋白质的工作流程：单个哺乳动物细胞被分选和裂解，然后裂解产物被分成两个部分，分别用于蛋白质和mRNA的定量。蛋白质拷贝数通过邻近连接实验和液滴数字聚合酶链式反应进行定量。mRNA拷贝数通过逆转录后的微滴数字PCR(下图)进行定量。
SCBC已经从技术层面改进了设备：将SCBC的通量提高到1000多个细胞；将多路复用能力扩展至每个细胞的42个分泌蛋白；简化设计以创建一个便携式设备。人们通过修改SCBC以实现双细胞测量，该测量用于探索细胞内信号如何依赖于两个细胞之间的距离。Kravchenko-Balasha等人研究表明，细胞内信号、细胞通讯和细胞距离的测量可以用热力学分析，以了解细胞的运动情况。Bhowmicket等人开发了一种结合SCBC和免疫金检增强型优点的便携式单细胞分析系统。他们利用明视场显微镜分析THP1单核细胞分泌的细胞因子，充分表征了该系统的性能，表明该系统不需要复杂的设备和笨重的仪器来读取和记录数据。基于Nanowell的免疫分析也被用来测量多种细胞因子的分泌，并在单细胞分辨率下检测抗体的分泌和抗原结合。在微型化的ELISAs策略中， ELISA和微流控设备的结合可用于单细胞研究中的细胞内蛋白鉴定。通过使用微型ELISA，Eyer等人定量测定单个U937细胞和HEK 293细胞中GAPDH酶的浓度，该系统在每个细胞中的灵敏度可达到的阿托摩尔水平。结合蛋白质组条形码技术和microELISA，人们最近发展了一种全自动单细胞蛋白质组技术，命名为IsoPlexis系统。IsoPlexis系统采用SCBC，包含数千个纳升级别的微室。该系统在微室中以高通量的方式分离数以千计的单细胞，然后用表面固定的抗体检测分泌蛋白和胞内蛋白。Isoplexis系统可以同时分析30多种分泌蛋白，在免疫治疗研究中细胞因子的多重检测中有着广泛的应用。
在基于液滴的微流体方法中，人们根据分泌抗体的结合或抑制活性，对皮升体积液滴中的单个细胞进行划分，以便高通量地筛选和分选抗体分泌细胞，并分析细胞因子分泌免疫细胞的细胞异质性。然而，这些检测方法中关于抗体分泌和抗原结合的检测结果仅基于终点数据，难以反映免疫反应的动态表达。为了克服这些限制，Eyer等人开发了一种基于液滴的微流控技术(DropMap系统)来研究破伤风类毒素免疫小鼠的体液免疫反应。DropMap可以对单个IgG分泌细胞进行大规模的并行动力学分析，同时测量抗体分泌率、特异性和对抗原的亲和力。Wheeler等人开发了一种新的方法，称为单细胞中的数字微流控免疫细胞化学(DISC)。DISC可以对刺激反应进行精确的剂量控制，从而能够在有刺激的脉冲上测定蛋白质磷酸化，时间短至3 s。
3.2 毛细管电泳-激光诱导的荧光检测
虽然条形码芯片或微室技术可以对细胞内蛋白质进行绝对定量，但由于抗体选择性有限并且会产生交叉反应，因此可能会导致假阳性结果的存在。毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)技术具有分离效率高、检测灵敏度高等优点，是一种很有前途的蛋白质定量技术。Xu等人开发了一种新的单细胞化学蛋白质组学策略来分析单细胞中低丰度的膜蛋白。Shih等人用荧光探针构建了一种特殊的LIF来定量单个细胞内低拷贝数的蛋白质。然而，由于蛋白质易吸附在毛细管壁上，检测的稳定性一直是毛细管分离方法的一大挑战，并给实际应用带来了困难。
3.3 单细胞的蛋白质印迹分析(WB)
WB是一种结合了高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析的蛋白质分析方法，具有容量大、灵敏度高、特异性高等优点。因此，它是生物和医学研究中普遍使用的一种工具，可用于特异性蛋白质鉴定并测量其水平，如信号通路、抗体活性检测和疾病的早期诊断。然而，传统的WB方法有一些局限性，比如费时费力，因为大多数步骤都是手动完成的。另一方面，WB方法通常需要微克级的样本，这在处理只包含少量蛋白质的痕量样本方面面临着严峻的挑战。为了解决这些问题，在过去的十年里人们已经开发了许多基于毛细管和微流控平台的小型化WB技术。微型WB的引入大大减少了蛋白质分离时间(在几分钟内)和样品需求(250 ng蛋白质，≈1000细胞)，同时能够实现自动操作、多路复用检测和高通量能力。为了进一步增加样品通量和促进自动化，人们已经开展蛋白质的凝胶内筛选、固定化和检测研究。原位免疫印迹方法的创新使微尺度的WB下降到单细胞水平，为研究细胞异质性提供了前所未有的机会。
2014年，Amy Herr等人开发了scWB方法来监测大鼠神经干细胞的单细胞分化和对丝裂原刺激的反应。scWB的原理和工作流程如图2C所示。ScWB由显微镜载玻片和用微孔阵列化的光活性聚丙烯酰胺(PA)凝胶薄层组成。细胞通过重力沉降加载到样品孔中，然后用电泳缓冲液裂解。在电场作用下，单细胞中的蛋白质在PA凝胶中被分离。分离后，人们用紫外光将蛋白质立即固定到3D PA凝胶上，然后与一次和二次荧光标记的抗体凝胶孵育，以检测蛋白质靶标。ScWB方法的灵敏度与流式细胞术(FC)相当，可以用溶出法和探针法检测到数十种蛋白质，但动态范围相对较小。在单细胞分辨率下，scWB成为研究复杂细胞群体的一种很有前途的通用工具。最近，Li等人开发了一种单细胞转染分析芯片(ScTAC)，以快速准确地评估瞬时转染效率，该芯片广泛应用于细胞和分子生物学研究。scTAC可以监测数千个单个宿主细胞中外源基因的表达。Grist等人引入3D单细胞免疫印迹检测数百个单个哺乳动物乳腺和脑肿瘤细胞的胞浆蛋白和核蛋白。
虽然scWB的斑点蛋白电泳图谱保留了与微尺度WB相当的理论孔板，但芯片上的整体分离分辨率略低。scWB在检测低丰度蛋白和小分子蛋白方面面临着重大挑战，因为在分离和免疫印迹的过程中，蛋白条带会迅速扩散到缓冲溶液中。为了克服这些限制，Zhang等人提出了自己的观点，即利用四唑功能化的光活性水凝胶发展出一种增强型单细胞免疫印迹方法。通过点击化学，该水凝胶可以在几秒钟内完成与蛋白质近端亲核体的四唑亲电加成反应。快速有效地捕获分离蛋白可以抑制蛋白质带在凝胶中的过度扩散，进一步降低芯片上的自发性荧光。另外，目前的scWB方法严重依赖于荧光读数，在需要多轮抗体剥离和重新检测中容易出现信号丢失。最近，Lomeli等人通过使用金属标记的二抗引入带有MIBI-TOF读数的scWB，使scWB方法具有多路复用能力。此外，抗体孵育是凝胶内免疫印迹方法中最关键的步骤之一，因为抗体分子进入湿润的水凝胶受到大小排斥、疏水-疏水和静电相互作用的阻碍。在这方面，人们已经做了很多努力来提高抗体在凝胶中的浓度，这极大地改善了抗体在scWB中的孵育性能。
3.4 基于邻近连接技术的分析方法
虽然基于抗体的免疫分析是一种功能强大且应用广泛的方法，但它们在检测灵敏度和特异性以及对高质量抗体识别靶蛋白的依赖性方面仍然存在局限性。在PLA中，人们设计含有适配体或抗体寡核苷酸复合物的配对邻近探针用来与目标蛋白结合。连接在结合蛋白上的重叠序列随后可以被延伸和扩增。这样，蛋白质的检测就可以转化为利用qPCR进行DNA测序的测量输出。基于双重抗体识别和强大的定位信号放大，PLA为细胞和组织切片中目标蛋白的定位检测提供了更高的检测灵敏度和特异性。Hu等人报道了一种基于微流控数字聚合酶链式反应芯片的聚乳酸用于低浓度蛋白质定量的方法。该方法的检测限低至毫微摩尔水平，线性动态范围在三到四个数量级。鉴于这些优势，PLA有可能克服在单细胞分析中检测低丰度蛋白时遇到的障碍。PLA已经与微流控芯片集成，用于分析系统细胞信号通路的高含量信息。通过监测mTOR、p70S6K和S6蛋白的磷酸化，微型化的PLA芯片在单细胞水平上解决了PDGF刺激下Akt通路的信号转导动力学问题。
PLA可以很容易地集成到单细胞测序方法中，从而能够对单细胞中的蛋白质和转录本进行多路定量。Albayrak等人开发了一种数字PLA(dPLA)方法，它结合了PLA和数字PCR，能够对单个细胞中的蛋白质和mRNA进行绝对定量，如图2D所示。然而，在微孔板中通过分选和裂解单个细胞而引入的较大稀释因子限制了dPLA在单细胞分析中的应用。Lin等人开发了一种用于dPLA测量的自动化微流控设备，大大提高了dPLA的灵敏度，并且每个细胞的检测效率低至29个蛋白质分子。Nolan等人开发了PLAYR (PLA For RNA)，用于质谱分析高度多重的转录组，可以实现40多种不同的mRNA和蛋白质的同时定量。此外，PLA和类似的方法已经被用来同时测量单个哺乳动物细胞中的mRNAs和蛋白质，以研究细胞的功能和反应。
尽管最近基于dPLA的方法取得了一些进展，但一些局限性阻碍了当前PLA方法在单细胞蛋白质分析中的许多应用。首先，SELEX(指数富集的配体系统进化技术)的适配体筛选过程很复杂，可能得不到合适的高亲和力抗体。其次，PLA中的靶蛋白必须有两个抗体结合位点才能与寡核苷酸重叠，但抗原表位的可用性和分子拥挤限制了抗原的识别。此外，在样品中加入过多的核酸探针可能会提高背景噪音，从而影响微量蛋白靶标的定量。
3.5 微流控流式细胞术法
荧光FC是一种在单细胞水平上进行高通量和多重分析蛋白质的方法。FC的一般原理和应用已被详细综述。流体中带有荧光标记抗体的细胞在通过荧光激活细胞分选器(FACS)时可以快速从混合细胞群中分离出来。FC是一种在单细胞水平上分析蛋白质的高通量和多路复用的方法。结合荧光细胞条形码，如图3A所示，FC可以对单细胞进行高含量、多参数分析，使其成为基础生物学和临床研究(包括信号通路分析、生物标志物发现和药效学评估)的重要工具。虽然FC在单细胞分析中提供了显著的灵敏度、靶标多路复用和高通量，但商用FC仪器体积庞大、价格昂贵，并且需要训练有素的人员进行操作和维护。此外，常规FC的样品制备需要大量的细胞(1×106mL−1)。这些限制使得传统的FC方法不适合在资源贫乏以及样本稀少的情况下应用。
图3 基于抗体法的单细胞复合蛋白分析
A)荧光细胞条形码(FCB)技术的原理：每个样品用含有不同浓度的胺类活性荧光染料的甲醇渗透，每个样品可以产生一个独特的荧光信号。然后样本被洗涤，合并到一个试管中，并用抗体染色。在FCB技术中，每个样本中的磷酸特异性抗体的荧光都被测量。在曲线图中，虚线表示自发性荧光，红色直方图表示样品荧光。B)成像流式细胞术的工作流程。C)通过对CITE-Seq中使用的DNA条形码抗体的说明，可以对脐带血单个核细胞进行详细的多模式表征。B、B细胞；T、T细胞；NK、自然杀伤细胞；mono、单核细胞；DC、树突状细胞；pre，前体；ery，红细胞/原始细胞。D)REAP-Seq技术的原理：利用1664个可变基因的前十个显著主成分，对八个簇进行T-SNE可视化分析。E)ECCITE-seq捕获的多种细胞形态态的示意图概述。ECCITE-Seq可以同时检测转录组、蛋白质、克隆类型和CRISPR干扰。
人们已经开发出来结合微流控和小型化检测系统的微流控细胞仪，以提供单细胞分辨率的多参数蛋白质分析。Liu等人开发了一种名为μFlowFISH的集成微流控设备，用于鉴定自然微生物群落中的细菌。μFlowFISH可以在杂交腔室中进行16S rRNA荧光原位杂交(FISH)，在杂交腔室中，细胞和探针被电泳加载、培养和清洗，用于随后的流式细胞仪检测。μFlowFISH可以监测假单胞菌的数量。μFlowFISH可以将100-200个细胞加载到微芯片中，为从复杂样品中定量检测微生物细胞提供了一个自动化和灵敏的平台。Wu等人开发了一个用于监测跨越多个时间尺度和细胞位置信号的微流控平台。该微流控平台无缝集成了两个组件：用于细胞培养、刺激和制备的四个垂直流体隔离微通道系列；两种基于单细胞分辨率技术芯片上的荧光成像，提供关于细胞事件的多路和正交数据。该微流控平台可分析包括原代细胞在内的多种细胞类型的信号通路。在过去的几十年里，人们致力于利用平面微流控技术开发高效的颗粒聚焦方法。与前人的工作相比，在高雷诺数和高流速下，粘弹性流体可以达到稳定的单流聚焦，从而实现了精确的高通量细胞术。这些方法简化了单流聚焦，并便于将其集成到合适的小型化光学系统和流体设计中。
3.6 流式细胞术
CyTOF，也称为质谱流式细胞术，是FC和MS的创造性组合，能够对细胞类型和状态进行高维、单细胞分析。在CyTOF中，抗体用稳定的稀土金属同位素标记，这些同位素在自然界中是不存在的，如图3B所示。重金属标记抗体探针从荧光读数到质谱检测的转变赋予了细胞荧光检测独特的优势，如更高的多重检测能力，更低的自发性荧光和背景噪声。CyTOF可以同时表征每个细胞中最多50个细胞表面或细胞内的标志物。此外，随着质量标记数量的增加，最大的潜在条形码能力将呈指数级增加。当与高维数据分析方法相结合时，CyTOF能够深入探索许多生物学问题中的信号通路，包括识别脑细胞亚型、跟踪免疫细胞分化和监测细胞中的信号转导。当与瞬时过表达技术相结合时，基于质谱的信号分析技术能够评估细胞内信号状态和蛋白质丰度的动态变化。Zhang等人在之前的工作中详细介绍了CyTOF在单细胞蛋白质组分析中的应用。
3.7 基于寡聚物标记的抗体编码蛋白质的研究
最近，人们用带有DNA标签的抗体检测蛋白质，并通过DNA测序读取信号结果。由于蛋白质信号输出可以由大量特定的DNA序列编码，因此蛋白质读出的多路复用容量几乎是无限的。例如，一个12聚体寡核苷酸可以产生1000万个不同的条形码。最近，Marlon等人开发了CITE-Seq，它结合了单细胞RNA测序和使用寡核苷酸标记抗体对蛋白质水平的多路测量，如图3C所示。人们用CITE-Seq同时分析人和小鼠免疫细胞的转录组和13种细胞表面蛋白。结果进一步表明，CITE-Seq不仅能正确识别不同的免疫细胞群，而且有助于鉴定已知的细胞亚型。通过CITE-Seq，他们可以识别不同自然杀伤细胞亚群在疾病条件下免疫反应调节中的不同作用，这是单细胞RNA-seq法无法检测到的。此外，CITE-Seq与商业上可用的单细胞平台(10x基因组学)完全兼容，应该可以很容易地适用于其他基于液滴、微孔和组合的高通量单细胞测序技术。
同样，Peterson等人开发了RNA表达和蛋白质测序分析(REAP-seq)，以利用DNA标记抗体和液滴微流体同时测量单细胞中的基因和蛋白质表达水平，如图3D所示。在这种方法中，一个由8个核苷酸组成的DNA条形码被连接到抗体上，提供了高达65536个独特的符号。REAP-seq用于评估CD27激动剂对人CD8+淋巴细胞的共刺激效应，并鉴定一种未知的细胞类型。2019年，Mimitou等人开发了一种CRISPR兼容的细胞转录组和表位的细胞索引技术(ECCITE- seq)，用于高通量表征来自每个单个细胞的至少五种形式的信息，例如转录组、蛋白质、克隆和CRISPR干扰，如图3E所示。ECCITE-seq能识别T细胞受体序列的差异，使抗原具有特异性。这些序列位于RNA分子的5′端，且scRNA-seq法很难检测到RNA 3′端的序列。
对于CITE-Seq和REAP-seq，表面抗原的检测是基于现有的FC和流式分选抗体。它有商品化的流动试剂，这些试剂对细胞活力影响很小。然而，如果要检测细胞内的抗原，人们很难实现抗体进入细胞膜。因此，人们需要筛选细胞固定化和破膜的试剂，以确保细胞内蛋白的mRNA和二级结构的稳定性。此外，未来应该开发更温和的允许抗体进入细胞的通透性方法，这可能使研究人员能够通过DNA偶联抗体方法对细胞内蛋白进行测序。
3.8 原位单细胞蛋白质分析方法
原位单细胞蛋白质分析对于理解异质生物系统的组织、调控和功能至关重要。由于有机荧光团的光谱重叠，荧光显微镜可以在单个细胞中进行有限的定量蛋白质分析。以前的一项研究报道了多光谱成像可以分离多达七个荧光团。然而，传统的基于荧光成像的方法的多路复用能力极大地限制了在单个细胞中原位分析许多不同的蛋白质。
近年来，成像质谱技术的进步和基于重复染色的技术已经使得在单细胞中原位分析高度多重的蛋白质图谱成为可能。反复免疫荧光法避免了专用仪器的昂贵价格，可实现样品的高通量分析。在重复免疫荧光法中，人们用不同荧光团标记的抗体在单个细胞中对其相应的蛋白靶标进行染色，然后在荧光显微镜下对细胞进行成像，以原位定量蛋白质靶标的丰度。荧光成像后，抗体的荧光信号被擦除，并开始了新的免疫荧光抗体染色和剥离周期。通过这种方式，重复免疫荧光有可能在单个细胞中对许多不同的蛋白质靶标进行原位定量。Gerdes等人开发了一种多重荧光显微镜方法(MxIF)，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织中多种分析物的定量、单细胞和亚细胞表征。每一轮图像采集后荧光染料的轻微化学灭活不影响重复的免疫荧光分析。他们在单细胞染色模式下检测了61种不同的蛋白质表位，并在747名结直肠癌患者中发现了肿瘤异质性。然而，化学漂白和抗体剥离往往会导致样品的降解，因为化学试剂可能会破坏蛋白质的表位，并影响随后的染色周期。为了在有效消除染色信号的同时保持抗原表位的完整性，人们已开发出一些基于DNA链置换反应的重复免疫荧光方法。然而，笨重的寡核苷酸会干扰结合抗体的结合亲和力和特异性。
为了解决这个问题，Guo等人提出了自己的观点。他们发展了一种使用可切割荧光抗体(CFA)高度多元化的单细胞原位蛋白质分析方法。在蛋白质靶标染色后，人们可以用温和的还原剂有效地切割荧光团，同时保持抗体的结合亲和力和特异性。他们用CFAs在单细胞中原位标记了12种不同的蛋白质，发现蛋白质靶标的抗原性在孵育后被很好地保存了下来。因此，基于CFA的方法有可能对单细胞中的100多个蛋白质靶标进行原位定量。为了进一步提高灵敏度和样品吞吐量，Liao等人开发了一种使用可切割的荧光酪酰胺和现抗体的逐层信号放大方法。与传统的基于荧光成像的方法相比，该方法提高了检测灵敏度，减少了1-2个数量级的成像时间，并有可能在光学分辨率下应用于鉴定单个细胞中数百种蛋白质的表达。
由于缺乏来自二次抗体、原位蛋白的信号放大，免疫荧光成像方法往往存在灵敏度降低和样品通量低的问题。因此，人们需要采用原位信号放大技术来提高样品的通量和灵敏度，特别是对细胞内低丰度蛋白质靶标的成像。Saka等人建立了一种基于信号交换放大免疫染色(Immuno-SABER)的高灵敏原位蛋白质组学方法。在Immuno-SABER中，蛋白质靶标与其相应的多个DNA条形码一抗染色，这些抗体与引物交换反应产生的正交单链DNA串联体杂交。然后，许多荧光成像寡核苷酸与DNA级联体杂交，实现信号放大。结合SABER扩增和荧光成像链的快速交换循环，免疫SABER可以实现快速、光谱无限的多路复用，用于原位蛋白质成像。他们在不同的样本中展示了5到180倍的信号放大，包括培养细胞、冰冻切片、福尔马林固定的石蜡包埋切片和整体组织。更重要的是，Immuno-SABER是可扩展的，每个蛋白质靶标都可以单独调节，以适应单个细胞中蛋白质组的高动态范围。
4. 非靶向蛋白分析方法
基于免疫染色的蛋白质组学对于在不同细胞模型中高通量、多重的蛋白质表达谱是至关重要的。然而，基于免疫染色的蛋白质组学也有四个主要不足：第一，抗原的选择和相应抗体的检测是基于先验的免疫学知识，这意味着基于免疫染色的方法不适合于探索性研究。其次，并不是所有感兴趣的靶抗原都能被检测到，因为它高度依赖于商业化抗体。第三，由于抗原结合亲和力的不同，人们很难开发一种简单而准确的蛋白质绝对定量方法。此外，基于抗体的方法的通量和准确性受到细胞通透性、分子拥挤、表位可及性和交叉反应性的限制。为了克服这些局限性，人们提出了几种基于高分辨质谱的单细胞蛋白质组学方法，用于对单个细胞中数千种蛋白质进行定性和定量分析。
为了在基于MS的单细胞蛋白质组学方法中进行深入的、定量的蛋白质组图谱分析，人们需要对纳米级的生物样品进行高效的小型化样品处理。近年来，人们基于样品制备方法的微流控芯片和集成蛋白质组分析设备(iPAD)对数百个细胞样本的蛋白质组进行了许多研究。纳米液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(Nano-LC-ESI-MS/MS)是目前最灵敏的基于MS的蛋白质组学工作流程和综合表征复杂蛋白质样品的仪器之一。近年来，微流控装置和纳米级分离技术被应用于纳米LC-MS的单细胞蛋白质定量，极大地提高了样品制备效率，最大限度地减少了样品体积。其中，一些单细胞MS平台，如纳米液滴及纳升尺度的油气滴(OAD)芯片可用于单细胞蛋白质组的定量分析。
4.1 基于纳米LC-MS的单细胞蛋白质组分析
通过将基于芯片的纳米液滴平台连接到LC-MS，Zhu等人开发了基于芯片的nanoPOTS，用于小细胞群体蛋白质组样本的处理和分析，如图4A所示。有了nanoPOTS平台，在无壁玻璃反应器中的总处理量已从传统的0.5 mL离心管中的几百微升减少到不到200nL。整个加工过程中的液滴较小，这大大减少了样品转移和注射过程中的样品损失。结合超灵敏的NanoLC-MS，他们从10个HeLa细胞中可以鉴定出3000多个蛋白质，这表明了nanoPOTS在单细胞蛋白质分析中的潜力。随后，Zhu等人提出了自己的观点，即将nanoPOTS平台与荧光激活细胞分选(FACS)相结合，实现了对单个哺乳动物细胞内蛋白质的分析。利用FACS-nanPOTS，他们在单个HeLa细胞中鉴定了大约670个蛋白质组。通过使用MaxQuant Run Match(MBR)算法，FACS-nanPOTS显著提高了灵敏度和蛋白质组覆盖率，并可以从含有亚纳克蛋白质的样本中检测到1000多种蛋白质。同时，FACS-nanPOTS可以从酶解的人肺原代细胞中区分细胞类型，并且可以识别上皮细胞和间充质细胞的特异性蛋白标志物。
图4 基于质谱的单细胞蛋白质组学方法
A)纳米机器人工作流：利用流式细胞仪分纳米细胞，然后裂解细胞，提取蛋白质，变性、还原、烷基化，最后在FACS-nanoPOTS芯片中水解成多肽。最后人们用超灵敏的nanoLC-MS对多肽进行分离和测序。B)微流控纳米液滴技术与串联质量标签(TMT)等重标记技术相结合，显著提高了单个哺乳动物细胞的分析通量和蛋白质组覆盖率。等重标记有助于对单细胞大小的蛋白质数量进行多重分析，深度为≈1600蛋白质，变异系数为10.9%，相关系数为0.98。C) SCoPE-MS概念图和工作流程：单独挑选活细胞，超声裂解活细胞，裂解产物中的蛋白质用胰蛋白酶水解，得到的多肽被TMT标记，结合LC-MS/MS分析。D)等重标记动态范围的表征和SCoPE-MS可变性的模拟：HeLa胰蛋白酶水解液用TMT标记，并按比例汇集在一起。我们将前n个高强度多肽(n=10，洋红色；n=100，蓝色；n=1000，青绿色；全部，紫色)的比值分布中位数(点)和中位数绝对偏差(MAD，须线)与它们的理论对数比值进行比较。
令人鼓舞的是，随着样品处理效率的提高以及分离和质谱技术的进步，无标记和多重单细胞蛋白质组工作流程都受益于检测灵敏度的提高。nanoPOTS-MS平台还被用来测量细胞分化过程中蛋白质组变化的进程。虽然该工作流产生了70%的单细胞蛋白质组覆盖率，但分析通量相对较低(每天≈8个单细胞)。要实现对大量细胞的有效分析，我们需要更高的分析通吐量。为了解决这个问题，Dou等人将nanoPOTS方法与TMT等重标记方法相结合，以提高单个哺乳动物细胞的分析通量和蛋白质组覆盖率，如图4B所示。nanoPOTS-TMT平台能够在2天内从3个小鼠细胞群(上皮细胞、免疫细胞和内皮细胞)的72个单细胞中鉴定出超过2300个蛋白质。通过将nanoPOTS与NanoLC-MS相结合，Cong 等人实现了单细胞蛋白质组超过70%的覆盖率，并确定了362个蛋白质组，而不是之前报道的211个蛋白质组。为了提高样本通量和方法的稳健性，Williams等人进设计了纳升规模的自动取样器，并将其用于nanoPOTS的样品制备与自动化LC-MS平台的集成。为了提高单细胞分析中蛋白质组的覆盖率，Kelly团队将高场不对称离子迁移率光谱(FAIMS)与nanoPOTS方法、超低流量NanoLC和最新一代Orbitrap Eclipse三合一质谱仪相结合。随着FAIMS的加入，这一超灵敏的单细胞蛋白质组学工作流可以鉴定1000多个蛋白质。这种组合方法大大提高了单细胞蛋白质组的覆盖率，他们还利用MaxQuan的MBR算法额外鉴定了约1500个蛋白质。
为了防止蛋白质流失和过度稀释，Shao等人开发了一种用于单细胞分析的新iPAD (iPAD-1)。在iPAD中，选定的单个细胞被直接吸入内径为22µm的毛细管，然后同时裂解和水解。优化的超灵敏nanoLC-MS/MS系统可以在1h内从单个HeLa细胞中鉴定出328个蛋白质，该平台具有选择活细胞的能力、细胞处理体积极小、超高灵敏度和快速等优点。为了最大限度地减少样品损失，提高单细胞蛋白质组分析的样品注入效率十分重要，Li等人描述了一种纳升尺度的OAD芯片，用于实现复杂的多步鸟枪式预处理和进样。与传统的管内系统相比，基于OAD芯片的系统表现出三个独特的优势：丰富的序列覆盖率、丰富的疏水蛋白和丰富的酶水解效率。
4.2 基于串联质谱标签的单细胞蛋白质组分析
SCoPE-MS是最近发展起来的一种对单个细胞中一千多个蛋白质进行定量的方法。该方法采用两个核心成分(如等重标记和载体蛋白质组)的策略来分析单细胞。人们将稳定同位素(如2H、13C、15N和18O)引入蛋白质组样品，而同位素编码的亲和标签(如串联质量标签(TMTs))具有相同的质量但包含独特的质量条形码。然后，SCoPE-MS通过多肽碎片检测TMT，以实现蛋白质和水解肽的相对定量。在Scope-MS方法中，所有单个细胞的肽都用具有相同完整质量的TMT编码。因此，所有样品的多肽在MS图谱中显示为一个峰，从而增加了低丰度多肽离子的信号强度，如图4C所示。基于TMTs的方法的另一个优点是，在MSn分析中，由于多肽离子包含独特的质量条形码，因此人们可以通过肽碎裂来分离和鉴定肽离子。使用SCoPE -MS，Budnik等人在小鼠胚胎干细胞的分化过程中量化了一千多种蛋白质，而且它可以定量大多数的丰富蛋白质(每个细胞超过105个拷贝)和只有低丰度的少数蛋白质(每个细胞超过 104个拷贝)。
对于SCoPE-MS，“载体蛋白质组”样本(通常是细胞或组织的混合物)被添加到单细胞蛋白质组中，水平从25倍到500倍不等，以便于更多多肽的选择和鉴定。然而，高水平的载体蛋白质组(>200倍)可能会损害定量的准确性和生物学结论。这是因为质谱仪采样的离子数量是受限的，载体蛋白质组水平的任何增加必然会减少从单细胞群体中采样的离子数量。此外，多路蛋白质组数据中每个通道中的肽信号需要转换成比例。然而各种因素，如酶水解效率、翻译后修饰(PTMs)和肽谱匹配的不确定性，都会影响测量结果。因此，我们有必要检查高载体蛋白质组水平是否会影响质谱仪的动态范围，从而限制SCoPE-MS方法的准确度。Cheung 等人根据质谱仪的动态范围、多路复用水平和采样离子的数量，提出了载体蛋白质组量与定量准确度之间的关系，如图4D所示。他们证明，载体蛋白质组水平的增加需要相应地增加采样离子的数量，以保持定量的准确性。同时，他们引入了一种名为SCPCompanion的软件工具，以实现对单细胞蛋白质组数据的快速评估。SCPCompanion可以指导实验设计和推荐SCoPE-MS中的数据收集和数据分析参数。
4.3 毛细管电泳-质谱法
CE-MS是一种将电泳技术与质谱技术相结合的蛋白质组学技术，可以快速有效地分离具有纳升和皮升样品体积的生物分子。CE-MS方法的优点之一是能够在单个细胞中分离大量的高极性和离子型代谢物。此外，CE-MS由于其多维、快速和高分辨率，是一个很有前途的多肽和蛋白质分析平台。然而，CE-MS不适合分析高分子量(>20 kDa)的蛋白质，因为它们在酸性背景电解质中沉淀。CE-MS方法在单细胞分析中的另一个挑战是在CE分离前缺乏有效的样品预富集，导致与LC-MS方法相比灵敏度较低。为了解决这个问题，Lombard-Banek等人。在自下而上的蛋白质组学工作流程中，将定制设计的单细胞CE平台和CE-微流电喷雾离子源(μ-ESI)集成到高分辨率串联质谱仪中，通过测量16-细胞非洲爪蛙胚胎单个卵裂球中低至0.2%的总蛋白含量，实现了500-800个非冗余蛋白质组的鉴定。与纳米液相色谱相比，nano-ESI-HRMS可以通过对单个非洲爪蟾胚胎细胞中大量的多肽进行测序来鉴定1709个蛋白质。通过对数百种蛋白质的量化，他们揭示了细胞之间的翻译差异，这些差异在发育过程中产生了不同的组织。2019年，Lombard-Banek等人建立了一种集原位亚细胞毛细管微量采样、单管提取和水解、肽分离和质谱检测于一体的方法。通过它们的综合设计，CE-MS方法对蛋白质的检出限达到700zmol(42万个拷贝)。他们通过分析X.laevis胚胎中单个细胞中大约5 ng的蛋白质水解液(小于总蛋白质含量的0.05%)，鉴定并定量了大约800个蛋白质组。通常，CE-MS方法在单细胞蛋白质和多肽分析中被认为是对经典MS方法的补充。
5. 多组学的单细胞分析
细胞活动和功能通过信号、表观遗传、转录和代谢途径的整合受到严格调控。单细胞基因组和蛋白质组技术的最新进展可以详细测量单个细胞中的RNA、mRNA、蛋白质和染色质状态，以进行表型鉴定。这些重要的进展极大地提高了对分子结构和细胞功能的理解以及它们在生理过程中如何受到干扰的能力。尽管有这些重要的进展，但它仍然缺乏能够有效地将细胞转录状态与细胞内、翻译后状态联系起来的“多重组学”技术。最近的技术突破已经将单细胞转录组数据与定量蛋白质和代谢物的测量联系起来，这些技术主要是结合了qPCR和微流控芯片，以及结合了FC分选和条形码抗体与sc-RNAseq。
5.1 单细胞蛋白质组和转录组的多重靶向分析
5.1.1 单细胞免疫测序
Index-sorting策略与转录组学研究的结合有助于将免疫细胞表型映射到转录后蛋白和细胞内蛋白质活性，并解决了评估转录产物的一些固有限制。上述CITE-seq和REAP-seq将不同细胞表面蛋白的丰度转化为DNA条形码抗体，并能够同时测量单细胞中的蛋白质和mRNA。通过将抗体条形码策略扩展到基于5′端捕获的scRNA-seq方法，ECCITE-seq能够高通量表征来自每个单细胞的六种形式的信息，包括转录组、T细胞受体、表面蛋白和sgRNA等。因此，ECCITE-seq在检测表达表型方面可能比单独使用scRNA-seq更灵敏，因为scRNA-seq的损失率很高，但蛋白质检测的损失率很低。Mimitou等人引入了一种CITE-seq的变体，用于对同一细胞的染色质可及性、基因表达和蛋白质水平进行多模式分析。最近，Swanson等人利用基于液滴的多组学平台开发了一种新的scATAC-seq方法，它可以同时测量数千个单细胞的转录组(scRNA-seq)、表位和染色质可及性(scATAC-seq)。
虽然RNA和蛋白质表达的联合测量已经实现，但人们仍然缺乏合适的方法来可视化组合的转录产物-蛋白质数据集，以描述表达丰度和动态范围的显著差异。例如，目前人们尚不清楚在不同的实验设置下，蛋白质表达动态范围的抗体检测结果是否与已建立的基于流式细胞术的检测结果一致。此外，基于液滴的scRNA-seq方法仍然可能遗漏低于检测限的特定转录产物。为了克服这些限制，Mair等人开发了一种靶向转录组学方法，可以同时测定492个免疫相关基因和41个通常用于免疫表型的表面蛋白。通过将高通量靶向转录组学与寡核苷酸条形码抗体相结合，该集成方法非常灵敏，可以检测低丰度的转录产物，同时只需要传统scRNA-seq方法所需测序读取深度的十分之一。他们的研究结果还表明，验证寡核苷酸条形码抗体对于解释多组数据是必要的。最后，CITE-seq和REAP-seq与细胞内蛋白不完全相容，这是因为抗体非特异性结合的背景较高，分辨率有限。
5.1.2 结合scRNA-seq的流式细胞仪平台
最近，一些结合流式细胞术和scRNA-seq的新的单细胞方法被开发出来用于单细胞的多参数分析。基于FC的荧光原位杂交(FISH)已被用于同时测量单细胞转录水平和蛋白表达，以更深入地了解单个细胞中基因转录和翻译的调控。通过将细胞周期分析与单细胞转录和多重组织成像相结合，Lavin等人开发了一种多尺度免疫图谱策略来绘制早期肺腺癌病变的免疫微环境图。他们的结果表明，辅助免疫治疗策略有可能重新激活肿瘤浸润的淋巴细胞微环境，并将肿瘤反应转变为检查点阻断。Chen等人开发了一种新的单细胞方法，即基于蛋白质索引的染色质易开放区域测序 (Pi-ATAC)，它可以使用索引 FACS和量化细胞表面或细胞内蛋白质表位。Pi-ATAC可以同时识别单个细胞的表观基因组和蛋白质组的异质性，在单细胞水平上将细胞表型和环境与染色质的变异直接联系起来。Katzenelenbogen等人开发了用于大规模并行记录scRNA-seq和细胞内蛋白质活性的INS-seq技术。当与scRNA-seq结合时，INS-seq通过分析细胞内和翻译后修饰蛋白(PTMs)、信号通路和代谢相关蛋白，有可能发现新的免疫亚群，如图5A所示。
图5 单细胞多组学方法
A)scRNA-Seq(INS-seq)和细胞内蛋白测定的集成技术：INS-seq通过TF结合和代谢活性定义新的免疫亚群。B)M397细胞早期药物反应的单细胞蛋白质组学和代谢分析：人们收集BRAFi治疗过程中不同时间点的细胞，并使用基于微流控的单细胞条形码(SCBC)技术进行单独分析。每个细胞用六个不同类别的标志物水平表征。C)SCBC布局图和单个微型细胞室，以及一套条形码的典型荧光图像：对于蛋白质，抗体通过DEAL法固定在条形码上，然后抗体捕获细胞裂解物中的蛋白质，并使用Alexa Fluor 647(AF647)标记的检测抗体产生荧光读数。同样，代谢物特异性抗体被固定在条形码上，然后标记的代谢物与裂解细胞中的天然代谢物竞争抗体结合位点。为了检测Gluc-Bio探针，人们将AF555标记的链霉亲和素固定在条形码上，然后裂解细胞中的Gluc-Bio分子占据链霉亲和素的生物素结合位点。未被占据的位置被生物素-BHQ2分子填充，剩余荧光与细胞中Gluc-Bio分子的含量成正比。
5.1.3结合scRNA-seq的微流控/液滴平台
人们已经开发出与scRNA-seq相结合的自动化微流控/液滴平台，以在单细胞分辨率下同时检测miRNAs、mRNAs、蛋白质和PTMs。人们开发了一种可拆分的单细胞微芯片，用于在同一单细胞中进行全基因组转录和分泌细胞因子蛋白。类似的策略也可用于单细胞免疫动力学的量化。Park等人开发了一个基于Microwell的平台来研究数千个单细胞中的基因表达、蛋白质表达和翻译动力学模式。人们在具有特定蛋白质表达的非小细胞肺癌细胞系中观察到不同的转录-蛋白质相关模式。蛋白质-DNA相互作用在调控基因表达中起着关键作用，但解释蛋白质-DNA结合的细胞异质性如何影响基因表达的可变性仍然具有一定的挑战性。Rooijers等人开发了scDam&T-seq(伴随相同细胞信使RNA测序的单细胞DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定)，用于同时量化蛋白质-DNA接触和基因表达。他们的结果还揭示了基因组-核纤层的接触点或染色质可及性如何与单个细胞中的基因表达相关。
5.2 单细胞中代谢物和蛋白质的同时定量
与其他单细胞“组学”分析相比，代谢组学提供了更直接和动态的细胞表型。然而，在单细胞水平上测量代谢组是极其困难的，因为代谢动力学只有几秒钟的速度。此外，由于代谢物的结构多样性很大，人们不可能扩增代谢物或用荧光标志物标记小分子代谢物。处理这些问题的一种可能的解决方案是小型化抗体条形码微阵列。这种微芯片包含数千个纳米管，它们可以轻轻捕获单个细胞，并在控制良好的条件下进行培养。这些微室还允许对单细胞进行孵育、洗涤、标记和裂解步骤。通过这种方式，裂解物可保留在微室中，并用于随后对细胞内生物分子和代谢物的定量。
如图5B所示，Xue等人通过将表面竞争结合分析和蛋白质免疫分析结合到SCBC上，开发了单细胞综合代谢和蛋白质组学分析的化学方法。SCBC可以高精度地同时测量代谢异质性和代谢产物与信号蛋白之间的相互作用，为细胞代谢信号调节及其药物诱导的扰动提供更丰富的信息。随后，他们开发了一种超分子表面竞争分析来筛选谷氨酰胺类似物，并确定了当与SCBC结合时，磷酸化蛋白信号和细胞能量过程之间的新的相互作用。Zhang等人开发了一个基于微芯片的平台，用于同时检测罕见肿瘤细胞在单细胞水平上的葡萄糖摄取、细胞内功能蛋白和基因突变。Su等人使用基于微流控的SCBC技术来表征突变黑色素瘤癌细胞在5天药物治疗期间的细胞异质性，揭示了给药初始状态和药物耐受状态的细胞状态，如图5C所示。Xu等人提出了一种多维有机质谱流式细胞术，可以在单细胞水平上同时分析6种细胞表面蛋白和大约100种代谢物(包括脂质和氨基酸)。
虽然单细胞多组学技术发展迅速，但在应用时仍需特别注意。单细胞多组学方法的一个关键挑战是如何处理数据稀疏的问题，因为单个细胞的表观基因组和转录组的覆盖率仍然很低。其次，人们很难区分技术性噪音和细胞间的可变性。因此，人们在这方面仍然需要优化实验程序，并从根本上开发新的策略来完全克服这一限制。此外，目前的单细胞多组学方法成本较高，限制了其在复杂异质样品大规模分析中的应用。
6. 挑战和展望
在过去的很长一段时间里，由于缺乏合适的单细胞分离和捕获方法以及检测灵敏度，单细胞蛋白质分析的技术创新相对缓慢。随着微流控技术、纳米技术和分子生物学技术的发展，单细胞蛋白质分析在蛋白质组覆盖率、测定通量、检测极限和定量准确度等方面都取得了很大的进展。单细胞分离策略包括通过微孔阵列芯片、FC、微流控设备和基于液滴的方法进行细胞分选，允许在单个样本中同时快速处理数万个细胞。此外，高通量测序技术为我们提供了大规模的定量分子数据集，这极大地拓宽了蛋白质组表征的领域。单细胞蛋白质组学技术的发展呈现出清晰的发展轨迹：从对单个或几个目标蛋白质的鉴定发展到在单个细胞内进行多重蛋白质检测和多组学联合分析。
由于各种单细胞蛋白质组学方法已经应用于许多不同的生物医学研究领域，在实际应用中，研究人员往往会对合适的蛋白质分析方法的选择感到困惑。在此，我们概述了单细胞蛋白质组研究常用的定量方法，并从检测模式、多样性、吞吐量和灵敏度的角度列出了它们的主要技术指标，如表1所示。在选择合适的单细胞蛋白质分析方法时，我们应综合考虑蛋白质的物理化学性质、细胞定位、亲水性/疏水性和样品通量等选择策略。因此，我们还绘制了一个决策树来帮助普通读者更好地选择最合适的单细胞蛋白质分析方法，如图6所示。
表1 常用单细胞蛋白质分析方法综述
图6 决策树中最常见的单细胞蛋白质分析策略
尽管最近人们在单细胞蛋白质组技术方面取得了进展，但在深入了解单细胞蛋白质组的复杂性和动态性方面仍然存在挑战。例如，细胞中有许多复杂的生物学因素发生，包括剪接变异体、PTMs、大浓度动态范围和极低的蛋白质含量、蛋白质稳定性、瞬时蛋白质结合以及对细胞类型或生理状态的依赖性。因此，在单个细胞中选择性和灵敏地表征蛋白质仍较为困难。这些挑战表明人们需要开发更有针对性的单细胞蛋白质组技术来量化磷酸化和其他PTMs。正如哈佛医学院研究员Peter Kharchenko所指出的那样，“这将使该领域从基于丰度的简单模型转向更精确的动态描述。”此外，蛋白质组的复杂和动态性质决定了没有“一刀切”的蛋白质组学策略可以用来解决所有上述问题。目前的单细胞蛋白质组学方法需要在蛋白质的高灵敏度测量和高通量测量之间进行权衡。在蛋白质组学测量之前，我们需要在这两个方面中做出选择：使用基于抗体的灵敏方法测量少数蛋白质，或者使用高度多重的、无偏倚的方法检测大量蛋白质。
此外，未来的研究还需要解决单细胞蛋白质分析中样品制备方面的一些问题。例如，高效的单细胞分离是一项特别苛刻的程序，它需要更精确地处理和控制小体积的液体，以便快速运输和准确定位细胞。此外，细胞代谢组和多肽组是可变的，对采样相关的扰动很敏感，如温度变化、酶或化学处理以及机械操作。将单个细胞从复杂的环境中分离出来而不干扰其内容物是至关重要的。此外在这个过程中，有必要减少细胞内的生化活性和损伤导致的分析物损失。因此，我们需要探索一些有效的方法来减少细胞蛋白质组中与隔离相关的扰动。
此外，单细胞多组学技术的快速发展不可避免地给数据处理和分析带来了许多挑战。对于单细胞测序技术来说，将大型、复杂和多模式的数据集成到特定的生物模型和机制中仍然是一个巨大的挑战。多组学显示出在单细胞中同时测量多个模式的独特优势，这使我们能够更全面地描述细胞的行为和特性。然而，我们有必要制定适当的战略，将不同模式的数据联系在一起。为了获得更准确、更可靠的结果，人们需要在分析前对海量和混乱的数据进行适当的处理，以减少偏差，产生有意义的分析结果。此外，未来的研究需要解决多组学数据处理中的一些问题，如统一不同的采集模式，消除实验之间的批次效应。此外，单细胞多组学方法有来自数万个细胞的海量信息的计算负担。未来人们在单细胞多模式数据的综合分析方面将需要在算法开发方面付出更多努力，例如纳入新的随机索引策略、算法和开发精细的高性能代码。
在过去的二十年里，通过测量不同蛋白质在单个细胞中的差异表达，人们对许多细胞生理过程提供了更深层次的信息。每一种蛋白质信息都为我们提供了一个参考，通过它我们可以部分地观察细胞格局的动态。许多蛋白质的相互作用，复杂信号通路的激活，以及单细胞中的多模式组学，都共同定义了这一格局。我们相信，未来这些问题的解决方案将为我们带来更好的单细胞蛋白分析前景。
https://doi.org/10.1002/advs.202105932
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