科研 |川农：锯末堆肥对香菇碳水化合物和芳香氨基酸代谢相关基因表达的影响（国人佳作）

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编译：微科盟-刘俊杰，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

香菇（Lentinulaedodes）的营养价值和经济价值都很高，其产量超过全球蘑菇总产的五分之一。棕褐色菌膜形成是香菇生命周期的一个特殊阶段，因为棕褐色菌膜的厚度和深度越大，原基发育程度和子实体质量越好。有研究表明，基质堆肥可防止蘑菇发生病害、促进养分吸收和加速生长，但该方法香菇规模化种植中不常用，而是以新鲜锯末作为主要基质。

为系统了解基质堆肥后对香菇种植的作用及其分子机制，本研究以新鲜锯末和堆肥锯末培养的香菇为对象，探究其棕褐色菌膜形成期的生长与营养差异、差异基因和蛋白表达情况以及酶活差异。锯末堆肥（ND）后，香菇的生长速率提高、棕褐色菌膜形成时间缩短、棕褐色菌膜多糖含量提高。与新鲜锯末基质（CK）相比，堆肥后总氮含量提高可能是促进生长的原因。经转录组和蛋白质组测序后，在KEGG通路分析中，氰基氨基酸代谢、磷酸肌醇代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、磷脂酰肌醇信号系统、RNA聚合酶、淀粉和蔗糖代谢以及酪氨酸代谢通路中检测到差异表达的基因和蛋白质。锯末堆肥处理后，大量与芳香族氨基酸代谢和生物合成过程相关的差异基因上调，而碳水化合物活性酶差异基因下调，可能与基质中半纤维素和纤维素含量降低有关。该研究表明基质堆肥有助于高效生产优质香菇，同时揭示了其潜在的分子机制。

论文ID

原名：Cultivating Lentinula edodes on Substrate Containing Composted Sawdust Affects the Expression ofCarbohydrate and Aromatic Amino Acid Metabolism-Related Genes译名：锯末堆肥对香菇碳水化合物和芳香氨基酸代谢相关基因表达的影响期刊：mSystemsIF：6.496发表时间：2022.02通讯作者：Petri Penttinen & 辜运富
通讯作者单位：四川农业大学资源学院

实验设计

实验结果

1.堆肥对锯末质量的改变
堆肥后，锯末由红变深棕，纤维素、木质素、半纤维素和有机碳含量显著降低，总氮含量显著升高（P<0.05）（表1）。香菇在堆肥锯末基质的生长速率显著提高（P<0.05）（表1），棕褐色菌膜形成时期提前14天。以上结果表明堆肥锯末促进了香菇生长。 表1 新鲜锯末（CK）和堆肥锯末（ND）的理化特性，生长在以新鲜锯末和堆肥锯末基质上的香菇菌丝体生长速率和棕褐色菌膜多糖含量

不同的上标字母表示统计显著差异（P<0.05，n=3）。

 2.转录组分析
cDNA文库rawreads经Q20筛选后，各样品约43,000,000至49,000,000条cleanreads通过质检，占94%（附表1）。测序原始数据已上传NCBISRA数据库，登录号为PRJNA705065。70%-79%质检合格的序列比对到香菇基因组后，约84%比对成功，其中超过96%都是外显子（附表2）。CK与ND之间的基因表达水平（基于FPKM）相似（图1A），说明可用于差异表达分析。 

图1（A）FPKM密度分布。（B）CK组与ND组的差异表达基因（DEGs）。差异标准：FC≥1.5 或≤0.667 且 P <0.05。（C）DEGs经GO富集后，前20个最显著的项目。

 9455个注释基因中，表达水平较高的是编码以下蛋白的基因：假设蛋白，主要协同转运蛋白超家族（MFS）general substrate transporter，细胞色素P450，α/β水解酶、P-loopcontaining nucleoside triphosphate hydrolase protein、激酶样蛋白和WD40重复样蛋白（附表3）。与CK组相比，ND组的主要协同转运蛋白超家族（MFS）general substrate transporter、细胞色素P450和丝氨酸蛋白酶抑制剂等96个基因上调，含有胚胎晚期丰富（LEA）结构域蛋白、醛酮还原酶和α/β水解酶等139个下调（图1B）。DEGs经GO富集分析获得441个GO项目。在生物过程类别中，ND组的DEGs富集到芳香氨基酸家族代谢和生物合成过程以及分支酸等，却没有富集到纤维素和β-葡聚糖的代谢和分解代谢过程以及葡聚糖、多糖、细胞碳水化合物和多糖的分解代谢过程等项目（图1C，附表4）。在分子功能类别中，ND组的DEGs富集到内肽酶和肽酶抑制剂及调节因子活性、酶和丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、以及磷酸作用的碳氧裂解酶活性等。在细胞成分类别中，共有61个DEGs被分配到4个细胞膜GO项目，其中24个DEGs被富集，而另外37个DEGs没有被富集。KEGG富集分析表明，DEGs富集到包含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（ko00400）通路等28条通路中（附表5）。 3.qPCR验证DEGs
18个DEGs的表达水平经qPCR验证，其中9个基因的表达水平通过了RNAseq和qPCR分析的差异丰度标准（表2）。8个基因中的4个属于GO项目中的细胞膜完整组分项目，4个基因中的2个属于GO项目中的芳香氨基酸家族代谢过程项目，3个基因全部被分配到GO项目中的催化活性项目而不是碳水化合物代谢过程项目。 表2 验证以新鲜锯末和堆肥锯末为基质生长的香菇棕褐色菌膜转录组DEGs的差异表达水平RNAseq和qRT-PCR验证的DEGs用粗体字表示。aP值小于0.01。b属于细胞膜完整组分项目的细胞组分类别 4.蛋白质组分析
基于TMT标记的多肽定量蛋白质组分析后，从“shiitake”数据库鉴定到2509和8407条多肽（附表6和附表7）。与CK组相比，ND组有187个差异表达蛋白（DEPs），其中74个上调，113个下调（图2，附表8）。GO分析表明，DEPs主要富集到代谢和单组分过程、细胞和细胞部分、以及催化活性和结合（图3）。ND组不存在水解酶活性、作用于糖基键、水解酶活性、水解O-糖基化合物等GO项目（(P <0.05）（附表9）。KEGG分析表明，ND组DEPs富集到74条通路（附表10）。蛋白互作网络分析表明，XP-007327210.1，XP-007325842.1，XP-007325855.1，XP-007328515.1，XP-007326488.1，XP-007326180.1，XP-007334384.1，XP-0073315491.XP-007332048.1，XP-007325723.1，XP-007325639.1，XP-007325271.1，XP-007326547.1，XP-007333581.1的连接度最高，是网络中的关键蛋白。这些关键蛋白中，除了XP-007325271.1是一种酰基载体蛋白/NADP泛醌氧化还原酶（ACP）之外，其他都是假设蛋白。XP-007326180.1，XP-007334384.1，XP-007331549.1，XP-007332048.1，XP-007325639.1都直接相互作用（图4）。 图2 以新鲜锯末和堆肥锯末为基质生长的香菇棕褐色菌膜的DEPs。差异表达标准：FC≥1.2 或≤0.833 且 P<0.05。 图3 以新鲜锯末和堆肥锯末为基质生长的香菇棕褐色菌膜的DEPs的2级GO富集
 图4 用STRING（v11）分析的DEPs蛋白互作网络。节点为蛋白，线条为蛋白互作关系。除了XP-007325271.1是酰基载体蛋白/NADP泛醌氧化还原酶（ACP）之外，其他都是假定蛋白。
 5.碳水化合物活性酶（CAZymes）分析
转录组中7.2%的DEGs是碳水化合物活性酶。1个碳水化合物酯酶（carbohydrateesterase），1个糖基转移酶和4个辅助酶（auxiliaryactivities）基因均上调，5个糖苷水解酶（glycosidehydrolase），3个碳水化合物酯酶，1个碳水化合物结合域，1个糖基转移酶和1个辅助酶基因均下调（表3）。蛋白质组中15.5%的DEPs是碳水化合物活性酶。3个糖苷水解酶和1个辅助酶蛋白均上调，14个糖苷水解酶，4个碳水化合物酯酶，6个辅助酶和1个多糖裂解酶蛋白均下调（表3）。 表3 以新鲜锯末和堆肥锯末为基质生长的香菇棕褐色菌膜转录组中注释为碳水化合物活性酶的DEGs和DEPs*, P valuelower than 0.01.*表示P值低于0.01。 6.转录组和蛋白质组的相关性
转录组和蛋白质组的皮尔森相关性系数为0.072。KEGG富集前20个通路中，有7个通路是转录组和蛋白质组共有的，分别是氰基氨基酸代谢、磷酸肌醇代谢、戊糖和葡萄糖醛酸间转换、磷脂酰肌醇信号系统、RNA聚合酶、淀粉和蔗糖代谢和酪氨酸代谢途径（图5）。转录组和蛋白质组都检测到3对DEGs和DEPs。LENED_010224及其对应的蛋白 A0A1Q3ELU5 和LENED_004417(A0A1Q3E6U4)在转录组和蛋白质组中均上调。LENED_009984(A0A1Q3ELG3)在蛋白质组中上调，在转录组中下调。GO分析表明，A0A1Q3ELU5和A0A1Q3E6U4属于内肽酶抑制剂活性和氧化还原酶活性项目（附表7）。KEGG富集分析表明，酪氨酸代谢、脂肪酸降解和糖酵解/糖异生3个通路有显著性（P值<0.05），并且均包含A0A1Q3E6U4。图5 以新鲜锯末和堆肥锯末为基质生长的香菇棕褐色菌膜的DEGs和DEPs的KEGG分析 7.酶活性测定
测定香菇棕褐色菌膜木质纤维素降解相关酶活性的结果为：果胶裂解酶活性范围约5至10UmL−1，β-葡聚糖的活性范围从低于10至约20UmL−1，纤维素酶的活性范围约16至25UmL−1，锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶的活性低于约7U mL−1（图6）。CK组和ND组的酶活没有统计学差异。 图6 以新鲜锯末和堆肥锯末为基质生长的香菇棕褐色菌膜的果胶裂解酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶活性。

讨论

棕褐色菌膜形成是香菇生长的一个重要阶段，与子实体的质量密切相关。因此，本实验采用了转录组和蛋白质组联合分析来探究生长基质的成分如何影响棕褐色菌膜的形成。堆肥锯末的木质素、纤维素和半纤维素低于未堆肥锯末，该结果与先前的研究一致，即富含木质纤维素的材料在堆肥时释放可溶有机中间产物，然而ND组和CK组的木质纤维素降解酶活性没有统计学差异。研究表明堆肥可能促进真菌生长。在本研究中，ND组的香菇棕褐色菌膜形成时间更短，菌丝体生长更快，可能是由于堆肥提高了氮含量，促进了真菌的生物量增加和生长效率提高。由于棕褐色菌膜形成是香菇多糖合成及积累的关键时期，因此可能解释了ND组香菇多糖含量较高的现象。堆肥锯末会影响香菇基因表达。与CK组相比，从ND组检测到235个DEGs和187个DEPs，分别有7.2%的基因和15.5%的蛋白被注释为碳水化合物活性酶，参与了多糖合成和细胞壁水解，在生长基质降解过程中发挥重要作用。差异表达的碳水化合物活性酶约有一半被注释为糖苷水解酶，水解碳水化合物内的或碳水化合物与非碳水化合物之间的糖苷键。在堆肥锯末生长的香菇中，大部分差异表达的糖苷水解酶和其它碳水化合物活性酶的表达都下调，或许是因为基质的半纤维素和纤维素含量更低。木质素过氧化物酶的主要氧化底物为芳香化合物，且氧化能力强，而漆酶的底物选择性低，能氧化大量化合物。木质素发酵产生了自由芳香化合物和各种不同的小分子，这或许是ND组漆酶活性提高而木质素过氧化物酶活性降低的原因。麦麸的主要成分是纤维素。基质中添加麦麸可能提高了纤维素酶的活性以降解纤维素。ND组的纤维素酶活性更高的原因可能是ND组的棕褐色菌膜形成时间与CK组不相同，所以两组并不处于同一生长时期。酶活测定实验表明，两组的酶活差异没有达到统计显著水平。生长基质可能影响营养物质交换和有害物质降解过程。微生物基因组编码的约四分之一转运蛋白都属于主要协同转运蛋白超家族（MFS）。MFS转运蛋白能分泌真菌抗体、有毒物质和其他代谢物，在转运单糖、多糖、氨基酸、多肽、维生素和许多小分子方面发挥重要作用。与CK组相比，ND组编码的主要协同转运蛋白超家族generalsubstrate transporter 和细胞色素P450的基因上调程度都很高，这表明该阶段的物质运输十分活跃。真菌细胞色素P450酶系统介导了多环芳烃、甾醇和烷烃的生物转化，而这些物质的积累又能促进胞色素P450的表达。研究表明香菇细胞色素P450参与菌柄伸长过程，这与本研究的结果一致，即香菇在ND组的生长速率提高，编码细胞色素P450的基因上调。转录和mRNA降解共同决定了mRNA丰度，而翻译和蛋白降解共同决定了蛋白丰度，因此转录组和蛋白质组的相关性不高。然而KEGG通路富集表明，转录组和蛋白质组有7条通路差异表达。淀粉和蔗糖代谢通路的P值在转录组和蛋白质组KEGG分析中都是最低的，或许是因为堆肥锯末基质的多糖含量更高、纤维素和半纤维素含量在堆肥前后存在差异。在堆肥锯末基质上，香菇的生长速率更快，可能反映了RNA聚合酶的表达水平有所不同。此外，磷酸肌醇代谢和相关的磷脂酰肌醇信号系统以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化也参与了生长代谢过程，香菇生长速率的差异或许与以上途径的差异表达有关。同样，氰基氨基酸代谢及其组分酪氨酸代谢途径的差异表达可能与堆肥和非堆肥基质之间的氮含量差异有关。

结论

本研究利用转录组和蛋白质组分析，探究新鲜锯末（CK）和堆肥锯末（ND）对香菇的棕褐色菌膜形成是否有影响。ND组的棕褐色菌膜形成时间更早、菌丝体生长速率更快，同时棕褐色菌膜的粗糖含量更高，这表明了生长基质经堆肥处理后能缩短香菇种植时间和提高棕褐色菌膜质量。ND组的氮含量增加可能是促进香菇生长的原因。在ND组中，大部分注释为碳水化合物活化酶的DEGs下调，或许是因为半纤维素和纤维素含量降低。与CK组相比，ND组编码主要协同转运蛋白超家族（MFS）general substrate transporter和细胞色素P450的基因都上调，表明该阶段的物质运输十分活跃。KEGG通路的改变或许与基质的纤维素、半纤维素和氮含量的差异以及香菇在堆肥基质上更快的生长速率和更高的多糖含量有关。 表4 测定β-葡聚糖酶活性的步骤原文链接： 

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35191774/

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