科研 |长春中医药：清肺饮通过NLRP3/mTOR通路激活自噬缓解肺炎（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

清肺饮（QFY）是一种中药方剂，以其对治疗细菌性肺部感染的优异药理作用而闻名，但其分子作用机制尚不清楚。本研究使用基于高效液相色谱-质谱 (HPLC-MS/MS) 的方法确定了QFY 化学成分，然后使用两种模型评估 QFY 对肺炎的保护性药理作用：肺炎链球菌诱导的体内小鼠模型和体外肺炎球菌溶血素(PLY)诱导的小鼠肺泡衍生的MH-S细胞系模型。结果显示，QFY 在体内和体外均表现出显著的抗肺炎作用。为了进一步探索 QFY 保护作用，本研究进行了 4D 无标记蛋白质组学分析、病理学评估和免疫组织化学 (IHC) 分析，以确定参与 QFY 保护的细胞途径。研究结果表明，NF-κB/NLRP3 和自噬途径可能与QFY相关的药理作用机制有关，即QFY通过下调上游NLRP3/mTOR信号通路事件触发自噬，从而改善炎症损伤。总的来说，此研究结果揭示了 QFY 预防肺炎的分子机制，为未来开发新的治疗方法以对抗这种疾病和减少抗生素滥用奠定了基础。

论文ID

原名：Activation of Autophagy Through the NLRP3/mTOR Pathway: A Potential Mechanism for Alleviation of Pneumoniaby QingFei Yin译名：通过NLRP3/mTOR通路激活自噬：清肺饮缓解肺炎的潜在机制
期刊：Frontiers in PharmacologyIF：5.811
发表时间：2022.01通讯作者：孙丽平 & 孙立伟通讯作者单位：长春中医药大学

实验设计

实验结果

1. QFY方剂的HPLC色谱图
HPLC-MS/MS方法已广泛用于分析各种草药中的主要化合物。在本研究中，我们使用该方法鉴定了QFY的 19 种主要化合物，这 19 种成分的总离子流(TIC)如图1A、B所示。为实现 QFY 组分的精确鉴定，我们使用CompoundDiscoverer 3.1进行保留时间校正、峰鉴定和提取。有关化合物名称、分子式、保留时间 (RT)、质量准确度和加合物的信息如表1所示。与我们的HPLC-MS/MS 结果一致，HPLC指纹中的14个主峰归属到QFY化合物中（图 1C）。由于胞嘧啶核苷、腺苷、咖啡酸、连翘苷和棕榈酸单甘油酯的比例非常低，因此我们未鉴定出它们的 HPLC 峰，也因而未将其用作相似性评估的参考峰。             图1 QFY方剂的HPLC色谱图
正离子(A)和负(B)离子模型中QFY制剂提取物的总离子流(TIC)。1-19的峰列于表1。(C) QFY方剂的HPLC色谱图。(D) 使用国家药典委员会中药指纹相似度评价系统(2004A)软件分析的10批QFY(S1-10)制剂的HPLC指纹图谱，紫外检测波长为266 nm。 表1 在Compound Discovery3.1库中使用HPLC-MS/MS分析19种化合物
2. QFY对肺炎链球菌（S.pn）诱导的肺炎小鼠模型肺病理学和炎症细胞因子的影响
我们用S.pn (2.5 × 108CFU/ml) 感染 48 小时后制备小鼠肺组织切片，检查小鼠肺组织的组织学变化以评估QFY对体内肺部炎症反应发展的保护作用。代表性的小鼠肺组织学显示广泛的肺炎迹象，我们观察到肺组织颜色加深，并伴有间质炎症、血管炎、支气管炎和水肿。肺叶充血肿胀，嗜中性粒细胞表现出浸润。QFY处理后，肺组织出血和肿胀减少。根据“方法”部分中描述的半定量评分系统，QFY处理小鼠的组织病理学评分要低得多，尤其是S.pn + QFY (H)组，表明 QFY可预防 S.pn诱导小鼠的肺炎症损伤（图2A-C）。我们接下来测量了气管肺泡灌洗液（BALF）炎性细胞因子的水平，以研究S.pn感染对肺部炎症的影响和QFY对S.pn诱导肺炎的保护作用。如图2D-F所示，S.pn感染导致BALF中 TNF-α、IL-1β和IL-6的炎性细胞因子水平显著增加（p < 0.01）。此外，与S.pn感染小鼠相比，QFY显著降低了 IL-1β 和 TNF-α 的水平，而 IL-6 水平没有显著降低（p > 0.05）。因此，上述数据揭示S.pn 感染引起的肺部炎症被QFY恢复。在这里请注意，对于 S.pn+QFY 组，除非另有说明，否则蛋白质组学和蛋白质印迹分析结果的描述是指高剂量 QFY (0.42 g/kg) 实验的结果。然而，QFY给药后小鼠肺部细菌负荷没有显著差异。图2 QFY在感染小鼠中预防S.pn诱导的肺炎症损伤
S.pn、S.pn + QFY(L)和S.pn + QFY(H)组小鼠在感染后 48 小时在 25 μl 中接种 2.5 × 108 CFU/mlS.pn。（A，B）肺组织的病理和组织病理学变化。用 H&E 染色的肺组织（原始放大倍数 ×40，比例尺：20 μm）。(C) 总肺部炎症评分。(D-F) QFY 对感染小鼠炎症因子的影响。数据表示为每个治疗组 n = 6 只小鼠的平均值 ± SD。*p < 0.05，**p < 0.01对比对照，#p < 0.05 ##p< 0.01对比S.pn，n.s.用于表示结果不显著。
3. QFY处理改变S.pn感染小鼠的蛋白表达
为了揭示 QFY 减轻 S.pn 诱导的小鼠肺炎的精确分子机制，4D 无标记定量蛋白质组学分析用于检查 QFY 治疗的 S.pn 感染小鼠肺组织中差异表达的蛋白质。在这里，我们使用基于 Pearson 相关系数的主成分分析 (PCA) 评估蛋白质定量的重复性。PCA 得分图揭示了组间的总体分类（图 3A）。对照组和 S.pn 感染组之间的组群聚集趋势很明显（即使两个对照样本被错误分类为属于 S.pn 感染组），QFY治疗组 (0.42 g/kg) 集群趋向于对照组，表明QFY处理是有效的。计算所有样本的量化表达值（在 log2 转换后）的Pearson相关系数（图 3B），并导致对照组和QFY治疗组结果之间的线性相关性加强（r > 0.97，S.pn + QFY-3样本除外）。在被量化的总共 5795 种蛋白质中，S.pn组与对照组相比鉴定出655种差异蛋白质（2倍变化截止值和 p < 0.05 值），其中上调蛋白433个，下调蛋白222个。为了进一步探索差异表达蛋白质的生物学意义，蛋白质根据GO功能注释术语进行分类（图 3C，D），主要分配给几个生物学过程，包括免疫和细胞因子产生的调节、对细菌的响应和防御反应。此外，与S.pn感染组相比，QFY治疗组有345种蛋白质差异表达。这些差异表达的蛋白质在病原体感染期间相对于上述其他过程显著富集。总之，这些数据表明 QFY 显著逆转了 S.pn诱导的宿主防御和免疫反应的改变。图3 组分类和 GO 功能注释(A) 使用 PCA 得分图对组分类进行整体可视化。(B) Pearson相关系数分析用于检测两组数据之间的线性相关性。当 Pearson 系数 (r) 最接近 -1 时，数据组呈负相关；如果 r 最接近 1，则数据组呈正相关；如果 r 最接近 0，则未发现数据组之间的相关性。(C,D) 差异表达蛋白质的 GO 富集分析显示在高级气泡图中。气泡大小表示属于给定途径的蛋白质数量，颜色表示 p 值。
4. QFY治疗通过NOD样受体和自噬信号通路减轻S.pn诱导的肺炎
为了进一步研究 S.pn 感染期间的 QFY靶点和 QFY 作用机制，我们对差异表达的蛋白质进行了基于 KEGG 的生物学分析。如图 4A-D 所示，36和13种差异蛋白分别富含 NOD 样受体和自噬信号通路。使用蛋白质印迹和免疫组织化学 (IHC)，我们进一步验证了代表性差异表达的蛋白质。NLRP3 是一种众所周知的 NOD 样受体，被 S.pn 侵袭激活，但在随后的 QFY 治疗后显著下调。值得注意的是，NLRP3 和 NF-κB 信号通路共同参与了细胞因子的释放，从而验证了其他代表性蛋白质参与上述信号通路。如图5A所示，S.pn感染后ASC、cleaved-casp1和磷酸化NF-κB p65蛋白的水平增加，QFY处理显著将这些蛋白表达恢复至正常水平。图4 QFY改变 NOD样受体和自噬信号通路的表达
(A,C) NOD样受体与自噬信号通路的KEGG相互作用网络图（红色表示差异表达蛋白）。（B，D）NOD样受体和自噬信号通路差异表达蛋白的热图（n = 6）。使用LC-MS/MS分析提取、分离和鉴定蛋白质。
值得注意的是，自噬已成为病原体入侵期间维持宿主体内平衡的重要过程。如图 5B 所示，S.pn感染后48小时mTOR磷酸化和p62积累表明mTOR 依赖性自噬受到抑制（图5C、D）。此外，在S.pn感染后，LC3B 降低和 Lamp2 荧光强度增加进一步证明了自噬改变（图5C，D）。相反，QFY阻断mTOR磷酸化和使S.pn感染后降低的LC3B水平恢复表明QFY通过促进自噬增强宿主防御能力。上述数据的证实表明，QFY通过下调NLRP3的水平和改善有缺陷的自噬来缓解S.pn诱导的肺炎。我们推测，即使在没有直接接触完整的S.pn生物体情况下，QFY也可能在体内发挥类似的保护作用，这促使我们通过研究 PLY 处理的 MH-S细胞作为体外肺炎模型来检验这一假设。图5 在对照、S.pn 和 S.pn+QFY (0.42 g/kg）组的小鼠肺组织中，使用蛋白质印迹分析 (A,B) 和 IHC (C,D) 验证与 NLRP3组成、自噬途径相关的关键蛋白的表达
LC3B、p62 和 Lamp2 蛋白的染色强度是相对于至少六个区域获得的DAPI染色结果计算的，结果来自四个独立实验。使用单因素方差分析和 Tukey后检验进行统计分析，数据以每组的平均值 ± SD 表示，*p < 0.05，**p < 0.01 与对照，#p < 0.05 ##p< 0.01 与 S.pn。
5. QFY对PLY诱导的MH-S细胞的效应
PLY 通过触发细胞死亡和逃避几种宿主防御机制，似乎在链球菌感染期间直接增加 NLRP3 的水平。为了进一步探索 QFY 对 S.pn 感染的保护性是否与 NLRP3 下调（以及自噬激活）有关，我们研究了 PLY 处理的 MH-S 细胞中关键蛋白的表达水平。在这里，MH-S 细胞与 PLY (400 ng/ml) 和低剂量 (25 μg/ml) 或高剂量 (50 μg/ml) QFY 共同处理 24 小时（图 6）。与此处获得的体内实验结果一致，PLY诱导NLRP3、ASC和cleaved-casp1蛋白水平增加，以及mTOR磷酸化和p62积累的增加，揭示自噬功能失调。此外，NF-κB信号通路被激活，正如IκBα减少（与对照组相比减少31.33%）和NF-κB p65 磷酸化（较对照组增加66.7%）所证实的那样，它们共同加剧了炎症级联反应。综上所述，上述结果表明，QFY的治疗效果与NLRP3减少和自噬激活有关。据报道NLRP3和自噬途径通过相互调节联系起来。自噬对于NLRP3的降解至关重要，而NLRP3可以作为一种新型的自噬抑制剂。这些观察启发我们进一步探索涉及NLRP3和自噬途径的双向调节机制并确定QFY靶点。图6 (A)和(F)通过蛋白质印迹检测的蛋白质表达
在(B-E)和(G-J)中对蛋白质进行量化，数据表示为每组的平均值±SD (n=3)，*p < 0.05，**p < 0.01对比对照，#p < 0.05 ##p< 0.01对比PLY。
6. QFY通过下调NLRP3/mTOR上游通路激活自噬
越来越多的证据表明，NLRP3 表达的上调取决于 NF-κB 通路的激活。同时，NLRP3作为mTOR的结合伴侣，参与抑制自噬的NLRP3-mTOR复合物的形成，从而抑制NLRP3降解，这是一个自噬依赖性过程。基于这些观察，我们进行 Spearman 相关分析以评估 NLRP3 通路蛋白水平与自噬之间的潜在关联。自噬相关蛋白工具肺炎症评分(TLIS)与炎性细胞因子IL-1β和TNF-α 水平之间存在高度显著的正相关。相反，NLRP3、ASC和caspase-1水平与p-mTOR/mTOR和 p62 水平显著正相关，与 LC3BII/I 和 p-ULK/ULK 水平显著负相关（图 7A）。总之，这些发现表明肺炎的发展伴随着自噬的阻断，NLRP3 和自噬通路相互负相关。图7 (A) 自噬和 NLRP3 信号通路的 Spearman 相关性分析。(B) MH-S 细胞对 PLY 刺激 (400 ng/ml) 的反应通过刺激后 6 至 48 小时进行的时间过程实验进行了探索。蛋白质在 (C, D) 中进行量化，数据以每组 (n = 3) 的平均值 ± SD 表示，*p < 0.05，**p < 0.01对比对照。
接下来，我们通过6- 48小时的时间过程实验，研究MH-S细胞对PLY刺激(400 ng/ml)的反应。如图 7B-D 所示，NLRP3 和 ASC 的蛋白质表达水平在感染后 6 小时没有显著改变。然而，在延长感染48小时后，NLRP3和ASC的表达与其各自的基础水平相比增加了3倍以上。正如预期的那样，PLY 治疗在 6 小时后诱导自噬瞬时增加作为防御反应，随着 NLRP3 继续积累，这种反应显著降低，表现为与对照组相比，LC3BII/GAPDH降低了58.56%。由于我们的上述结果表明 NLRP3 和自噬之间存在关系，我们试图使用 NLRP3 siRNA 和 PI3K 抑制剂 3-甲基腺嘌呤 (3-MA) 阐明QFY的确切分子靶点。图8 QFY 通过下调上游 NLRP3/mTOR 通路激活自噬
MH-S 细胞用纯化的 PLY (400 ng/ml) 刺激以诱导肺损伤模型，然后用 QFY (50 μg/ml) 处理 24 h。（A，E）通过蛋白质印迹检测的蛋白质表达。在(B-D)和(F-I)中对蛋白质进行量化，数据表示为每组(n=3)的平均值± SD，#p < 0.05，##p < 0.01。
与我们上述数据同时，QFY处理显著下调NLRP3通路成分并修复缺陷自噬（图8A，条带1-3），而3-MA抑制自噬反应，如p62增加和LC3B水平降低所示（如图8A所示，分别为条带4-5）。即使在存在3-MA的情况下，QFY也逆转了PLY诱导的NLRP3通路成员水平的增加。因此，这些结果表明，QFY通过抑制NLRP3而不是通过触发自噬途径来抑制PLY诱导的炎症反应。接下来，我们进一步探讨了NLRP3是否是QFY调节自噬和改善炎症的靶点。如图 8E，条带4所示，NLRP3表达沉默显著恢复了基础自噬水平，表明 NLRP3 降解可能参与了自噬的激活。总之，QFY抗肺炎链球菌作用似乎与通过下调涉及NLRP3/mTOR的上游自噬通路事件从而激活自噬有关。图9 QFY缓解肺炎的治疗机制概述
QFY通过下调上游NLRP3/mTOR信号通路事件触发自噬，从而改善炎症损伤。

讨论

本研究的主要结论可概括为三点。首先，QFY在S.pn诱导的体内小鼠模型和体外PLY刺激的MH-S细胞模型中均发挥显著的抗肺炎作用。其次，4D 无标记蛋白质组学分析表明，抑制 NLRP3 表达和修复自噬在 QFY 肺炎治疗中起关键的药理作用。第三，我们的数据和之前报道的其他研究结果表明，NLRP3 和自噬密切相关。在这里，我们发现QFY通过抑制上游NLRP3/mTOR信号通路事件触发自噬，从而改善炎症损伤。据全球疾病负担、伤害和风险因素研究 (GBD) 报告，下呼吸道感染在 2016 年导致 238 万人死亡，因此是一个严重的公共卫生问题。在儿童中，5岁以下的死亡人数占这些死亡人数的27.45%。肺炎链球菌引起的肺炎是下呼吸道感染的主要原因，每年造成超过 118.9 万人死亡。如今，抗生素耐药性导致用于治疗S.pn 感染的传统抗菌药物的有效性下降，因此需要制定减少抗生素使用的策略。中药已经实践了数千年，并且在用于治疗多种疾病和生理状况时被广泛认为具有治疗作用。事实上，一些基于中药方法的治疗效果已经得到实验证实。根据中医理论，“热毒”与肺炎密切相关。QFY具有清热解毒之功效，治疗肺炎疗效显著。在QFY成分中，黄芩苷、连翘苷和连翘具有抗菌和抗炎活性，而中药黄芩具有抑制癌细胞生长和减轻炎症的作用。然而，由于由中草药化合物制成的中药配方的可变性和复杂性，且目前缺乏支持其有效性的严格科学证据，它们的功效经常受到质疑。因此，符合生物医学的中药复方QFY研究对于其在临床环境中的接受度至关重要。因此，我们建立了基于S.pn感染的小鼠和PLY刺激的基于MH-S细胞的肺部感染模型，以研究 QFY 对肺炎的保护作用的机制。S.pn 诱导的肺炎小鼠肺组织 HE 染色显示广泛的感染迹象，如肺叶充血肿胀并伴有中性粒细胞浸润。然而，QFY可以显著减轻肺部感染的病理表现并降低细胞因子IL-1β和TNF-α的水平，QFY的确切作用机制将在下面详细讨论。高通量蛋白质组学工具被广泛认为可用于探索复杂中药系统的药理学。在这里，我们分别鉴定了36和13种差异表达的蛋白质，它们分别富含NOD样受体和自噬信号通路。自噬是一个重要的稳态过程，由包括病原体入侵在内的危险信号触发。与最近有关自噬和感染性疾病的研究一致，我们的结果表明，肺炎症损伤反映了自噬缺陷，如p62的积累和LC3B水平的降低也能证明这一点。相反，一些研究表明S.pn在感染的早期会刺激自噬。我们假设这些结果反映了在不同传染病时间点对S.pn的不同响应，促使我们通过进行时间进程实验来调查这种差异。随后，自噬很明显在感染后 6 小时略有增加，从而反映了其防御反应作用。然而，随着感染持续时间的延长，自噬减少，尤其是在感染 48 小时后。此外，自噬的减少伴随着组成型NLRP3的积累。在早期肺炎球菌性肺炎期间的肺组织中，随着感染持续时间和细菌负荷的增加，NLRP3似乎在保护性免疫中发挥着越来越重要的作用。例如，据报道，Nlrp3^-/-和Asc^-/-小鼠的宿主防御能力都显著提高（与每个基因具有功能等位基因的小鼠相比），死亡率显著降低，细菌生长和传播减少。重要的是，通过NOD样通路识别肺炎球菌肽聚糖和DNA，取决于重要的S.pn毒力因子—PLY的表达情况。PLY通过在肺上皮细胞和巨噬细胞的膜上产生跨膜孔起作用，导致细胞溶解和坏死。因此，免疫系统采用各种不同类型的 NOD 样受体来感知 PLY 诱导的细胞膜损伤。总的来说，本研究中获得的结果表明 S.pn 感染上调了 NLRP3 的水平并显著抑制了自噬。相比之下，QFY 处理显著抑制了 NLRP3 信号通路的表达，同时通过 mTOR 去磷酸化和 p62 降解来改善有缺陷的自噬。上述数据揭示了QFY处理导致NLRP3水平降低和自噬激活的信号通路之间的机制相似。事实上，我们的结果可能与之前的几项研究结果一致，这些研究表明 NLRP3 是 mTOR 的结合伴侣，因此 NLRP3 与 mTOR 的结合通过促进 mTOR 磷酸化来抑制自噬。NF-κB p65 是与 NLRP3 和细胞因子的表达相关的转录因子，正如这项工作的结果所支持的那样，NLRP3 mRNA和pro-IL-1β水平的变化与磷酸化 NF-κB p65表现出相同的趋势。为了进一步探索参与 QFY 调节 NLRP3 和自噬的精确靶点，3-MA 作为特异性自噬抑制剂，而 siRNA 用于沉默 NLRP3 表达。我们的结果证实，即使在存在 3-MA 的情况下，QFY处理也能逆转 PLY 诱导的 NLRP3 增加，而 NLRP3 siRNA 通过触发 mTOR 依赖性自噬来模拟 QFY 作用。mTOR 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由两种 mTOR 复合物形式组成，似乎是 NLRP3 和自噬信号通路之间的生化联系，如图 9 所示。

结论

总之，我们的结果表明，NLRP3 通过与 mTOR 结合来抑制自噬，而 QFY 通过下调 NLRP3 来逆转感染受损的自噬。本研究为进一步研究 QFY 和其他中草药治疗肺部感染性疾病的精确靶点和机制提供了理论依据。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35111047/

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